該研究結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)、微生物組學(xué)、代謝組學(xué)、分子對(duì)接及公共數(shù)據(jù)集分析等技術(shù)，系統(tǒng)探究了寧鄉(xiāng)豬源海氏腸球菌緩解大腸桿菌誘導(dǎo)仔豬腸道炎癥的作用及分子機(jī)制。研究證實(shí)，該菌株可通過恢復(fù)腸道菌群平衡、促進(jìn)乙酸和丙酸等短鏈脂肪酸合成，進(jìn)而抑制?MyD88-NF-κB?信號(hào)通路激活，減少促炎細(xì)胞因子表達(dá)，同時(shí)該機(jī)制在克羅恩病患者中存在潛在臨床相關(guān)性，為細(xì)菌性腸道炎癥的益生菌和后生元治療提供了新的理論依據(jù)和候選菌株。百邁客生物為該研究提供了細(xì)菌全基因組和16S?rRNA基因測(cè)序服務(wù)。

研究背景

腸道炎癥受菌群失調(diào)、飲食、免疫異常等因素誘發(fā)，克羅恩病等炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，大腸桿菌是引發(fā)腸道炎癥的重要致病菌，亟需研發(fā)有效策略抑制其增殖。益生菌是緩解腸道炎癥的潛在手段，乳酸菌及短鏈脂肪酸等益生菌代謝產(chǎn)生的后生元備受關(guān)注，但其生物活性和作用機(jī)制尚未完全闡明。嚙齒類模型無法充分反映人類腸道特征，而豬的腸道菌群、免疫反應(yīng)與人類相近，是研究腸道疾病的適宜模型。

研究結(jié)果

? 低腹瀉率寧鄉(xiāng)仔豬的核心微生物標(biāo)志物鑒定及海氏腸球菌的益生菌潛力驗(yàn)證

對(duì)比寧鄉(xiāng)仔豬（138?窩）和約克夏仔豬（179?窩）哺乳期腹瀉發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)寧鄉(xiāng)仔豬在7-21日齡腹瀉率顯著更低（日齡7天：30.2%?vs?44.1%；日齡21天：30.9%?vs?47.5%）；7日齡糞便樣本檢測(cè)顯示，寧鄉(xiāng)仔豬分泌型免疫球蛋白A（sIgA）濃度顯著高于約克夏仔豬，而防御素β2（DEFβ2）濃度無顯著差異。16S?rRNA基因測(cè)序分析表明，兩種仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著分離，寧鄉(xiāng)仔豬腸道內(nèi)擬桿菌門、變形菌門、梭桿菌門豐度更高，厚壁菌門豐度更低；屬水平上，梭桿菌屬、擬桿菌屬在寧鄉(xiāng)仔豬中富集，而未分類毛螺菌科、未分類Muribaculaceae在約克夏仔豬中豐度更高。

通過線性判別分析效應(yīng)量（LEfSe）篩選出9個(gè)差異豐度微生物，其中腸球菌屬與寧鄉(xiāng)仔豬sIgA水平呈強(qiáng)正相關(guān)（p<0.01，R2=0.651），且在其糞便中檢出率接近100%。從健康寧鄉(xiāng)仔豬糞便中分離該菌株，經(jīng)全基因組測(cè)序鑒定為海氏腸球菌，其呈均一球形，細(xì)胞形態(tài)完整，可利用乳糖、棉子糖、麥芽糖等多種多糖碳水化合物。該菌株對(duì)模擬胃腸道環(huán)境（pH?8.0人工腸液）、高濃度膽鹽（0.3%-0.4%）具有良好耐受性，抗生素敏感性檢測(cè)顯示其對(duì)青霉素、紅霉素等常用抗生素可控，符合益生菌候選標(biāo)準(zhǔn)。

小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)證實(shí)，口服該海氏腸球菌（10??CFU?/?只，連續(xù)3周）可顯著增加小鼠體重，提升小腸絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度，降低血清二胺氧化酶（DAO）、D?–?乳酸水平（腸屏障損傷標(biāo)志物），升高血清sIgA水平，顯著改善宿主腸道健康狀態(tài)。

寧鄉(xiāng)豬源海氏腸球菌抑制大腸桿菌定植并改善腸道炎癥體外抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，該海氏腸球菌對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其中對(duì)大腸桿菌抑制效果最顯著。構(gòu)建大腸桿菌誘導(dǎo)的仔豬腸道炎癥模型，將24日齡DLY仔豬分為對(duì)照組（CON）、大腸桿菌感染組（ETEC）、海氏腸球菌干預(yù)+大腸桿菌感染組（Eh+ETEC）。結(jié)果顯示，海氏腸球菌可逆轉(zhuǎn)大腸桿菌誘導(dǎo)的仔豬體重下降，16S?rRNA基因測(cè)序表明其能恢復(fù)感染仔豬腸道菌群α、β多樣性，降低變形菌門豐度，提升梭菌屬、普雷沃氏菌屬等有益菌豐度，顯著降低埃希氏?–?志賀氏菌屬的相對(duì)豐度和定植量。菌群網(wǎng)絡(luò)分析顯示，海氏腸球菌可恢復(fù)被大腸桿菌破壞的微生物群落穩(wěn)定性，提升腸球菌屬的生態(tài)地位。同時(shí)，該菌株能顯著降低仔豬血清腸毒素（ET）水平，恢復(fù)回腸sIgA水平，降低回腸黏膜促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6含量及TNF-α、IL-1β基因表達(dá)，有效緩解大腸桿菌誘導(dǎo)的腸道炎癥和腸屏障損傷。

? 乙酸和丙酸是寧鄉(xiāng)豬源海氏腸球菌發(fā)揮作用的核心功能代謝物

功能預(yù)測(cè)分析顯示，海氏腸球菌可調(diào)控丙酮酸代謝通路，全基因組測(cè)序證實(shí)其攜帶乙酸、丙酸合成相關(guān)基因（K00926、K0184）。仔豬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染顯著降低回腸食糜中乙酸、丙酸、戊酸濃度，而海氏腸球菌干預(yù)可特異性升高乙酸和丙酸水平（丁酸水平無顯著變化），且寧鄉(xiāng)仔豬糞便中乙酸、丙酸濃度顯著高于約克夏仔豬。構(gòu)建乙酸?/?丙酸干預(yù)的大腸桿菌感染小鼠模型，證實(shí)乙酸和丙酸可顯著抑制大腸桿菌在小鼠回腸的黏附與定植，降低血清ET、DAO水平，減輕腸道形態(tài)損傷，且丙酸的作用效果更顯著；同時(shí)可下調(diào)回腸組織TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6等促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)，證實(shí)乙酸和丙酸是海氏腸球菌緩解腸道炎癥的關(guān)鍵后生元。

? 乙酸和丙酸通過抑制MyD88-NF-κB通路緩解腸道炎癥

機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染可顯著激活仔豬、小鼠及IPEC-J2腸上皮細(xì)胞中?TLR4-MyD88-NF-κB信號(hào)通路，上調(diào)TLR4、MyD88、p65蛋白及基因表達(dá)，而海氏腸球菌、乙酸?/?丙酸干預(yù)可顯著逆轉(zhuǎn)該通路的異常激活。分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)證實(shí)，乙酸和丙酸可與MyD88蛋白直接結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)為PHE-285和ARG288，其中乙酸與MyD88的PHE-285形成氫鍵，結(jié)合親和力更強(qiáng)。乙酸和丙酸可上調(diào)大腸桿菌感染小鼠回腸組織單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（MCT1）表達(dá)，而海氏腸球菌可顯著升高感染仔豬回腸SLC16A1（編碼?MCT1）基因表達(dá)，提示SCFAs需通過MCT1轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。構(gòu)建腸道上皮細(xì)胞特異性MyD88敲除（Myd88?/?）小鼠模型，證實(shí)敲除MyD88可達(dá)到與乙酸?/?丙酸干預(yù)相似的效果，顯著抑制大腸桿菌定植、降低血清ET水平、緩解腸道炎癥，證實(shí)乙酸?/?丙酸通過靶向MyD88-NF-κB通路發(fā)揮抗炎作用。

? 克羅恩病患者存在SCFAs下調(diào)及MyD88-NF-κB通路激活，具有臨床相關(guān)性

挖掘克羅恩?。–D）公共數(shù)據(jù)集，代謝組學(xué)分析顯示，CD?患者糞便中丙酸、丁酸、丁酸?/?異丁酸濃度顯著降低，且與CD發(fā)病概率呈顯著負(fù)相關(guān)；另有研究證實(shí)?CD患者糞便乙酸水平（28.7±10.2?mmol/L）顯著低于健康人群（50.7±14.3?mmol/L，p<0.01）。RNA-seq?數(shù)據(jù)顯示，CD患者回腸組織中MyD88、TLR4?及?NF-κB家族相關(guān)基因（NFKBIA、NFKB2、NFKB1等）表達(dá)顯著升高，SLC16A1基因表達(dá)顯著降低，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌感染模型的分子變化一致，提示海氏腸球菌?–?乙酸?/?丙酸?–?MyD88-NF-κB?軸在人類腸道炎癥疾病中具有潛在臨床相關(guān)性。

研究總結(jié)

該研究指出大腸桿菌感染易破壞腸道穩(wěn)態(tài)引發(fā)炎癥，而抗生素、抗炎藥等傳統(tǒng)治療存在耐藥、菌群失調(diào)反復(fù)等局限，凸顯了益生菌療法的研究?jī)r(jià)值。該研究分離的寧鄉(xiāng)豬源海氏腸球菌具優(yōu)異益生菌特性，可通過產(chǎn)乙酸、丙酸調(diào)控腸道菌群，經(jīng)?MCT1轉(zhuǎn)運(yùn)后結(jié)合MyD88，抑制NF-κB通路過度激活以緩解炎癥，且首次證實(shí)該場(chǎng)景下乙酸、丙酸的調(diào)控作用優(yōu)于丁酸。同時(shí)，克羅恩病患者的SCFA水平降低、MyD88-NF-κB通路激活的特征，驗(yàn)證了該機(jī)制的臨床相關(guān)性。此外，研究也提及存在SCFA調(diào)控MyD88的分子細(xì)節(jié)未明、可能涉及其他代謝物?/?通路等局限，但該研究為細(xì)菌性腸炎及炎癥性腸病的益生菌、后生元靶向治療，提供了全新候選菌株與核心作用靶點(diǎn)，奠定了重要理論基礎(chǔ)。

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