該研究揭示甘露糖富集的Cetobacterium?somerae能將日糧中的精氨酸在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為腐胺，并由肝臟進(jìn)一步代謝為亞精胺，從而發(fā)揮減輕高脂日糧誘導(dǎo)的肝脂蓄積的作用，這一發(fā)現(xiàn)不僅闡明了腸道微生物與宿主之間跨界協(xié)同產(chǎn)生有益代謝物的全新機(jī)制，也為理解腸肝軸在代謝健康中的作用提供了突破性視角。百邁客生物為該研究提供了全長微生物多樣性測序服務(wù)。

研究背景

最新研究發(fā)現(xiàn)腸-肝軸涉及兩個器官間的相互作用，能通過多種微生物代謝物實現(xiàn)的雙向交流，表明腸道來源的細(xì)菌代謝物可能對肝臟健康產(chǎn)生正向或負(fù)向影響。為探究腸-肝相互作用，高脂飲食（HFD）模型是最成熟的實驗方法之一，腸道、微生物群與宿主肝臟之間的這種特殊相互作用表明腸道微生物可能產(chǎn)生許多尚未表征的代謝物，這些代謝物可循環(huán)至肝臟以影響肝功能。然而，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)任何腸道微生物代謝物經(jīng)肝臟代謝后轉(zhuǎn)化為有益于肝臟健康的成分。

研究結(jié)果

甘露糖補(bǔ)充緩解斑馬魚高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝

因為已有報道表明甘露糖可改變腸道菌群組成并緩解小鼠脂肪肝，為了確定通過甘露糖富集或選擇腸道菌群是否能改善肝功能，進(jìn)行了添加甘露糖的HFD喂養(yǎng)實驗。喂養(yǎng)試驗后，?HFD組斑馬魚的體重增長和肝臟三酰甘油（TAG）含量較正常脂肪飲食（NFD）組顯著增加，表明成功建立了營養(yǎng)性脂肪肝模型。與HFD組相比，NFD、5M（5?g/kg）和10M（10?g/kg）組通過降低肝臟脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，肝臟TAG含量顯著降低，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平顯著下降。H&E染色顯示，相比HFD組，5M和10M組肝臟的空泡數(shù)量和損傷評分明顯減少。5M和10M組肝臟促炎因子相關(guān)基因的表達(dá)也有所降低，總體而言，還觀察到HFD添加甘露糖后在形態(tài)學(xué)和分子水平上改善了斑馬魚的腸道健康。

圖1-甘露糖補(bǔ)充不能直接緩解HFD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性，但會促進(jìn)C.somerae的生長

甘露糖補(bǔ)充改變腸道微生物群并選擇性富集CETOBACTERIUM

與HFD組相比，5M組和10M組中變形菌門（Proteobacteria）的相對豐度顯著降低，而梭桿菌門（Fusobacteriota）的相對豐度顯著增加。與HFD組相比，5M組和10M組中梭桿菌屬（Cetobacterium）的相對豐度顯著增加。腸道微生物群的α多樣性指數(shù)（Chao1和Shannon）在各組間無顯著差異。LEfSe分析顯示，5M組斑馬魚腸道中梭桿菌屬（Cetobacterium）高度富集。梭桿菌屬（Cetobacterium）是梭桿菌門（Fusobacteriota）的一個屬，在魚類中僅由單一物種C.?somerae代表，該菌通常棲息于多種魚類的腸道中。

此外，PCoA顯示HFD組和5M組的腸道微生物群完全分離，表明甘露糖補(bǔ)充顯著改變了斑馬魚的腸道微生物群組成。Spearman相關(guān)性分析顯示，變形菌門及其包含的近緣單胞菌屬（Plesiomonas）和氣單胞菌屬（Aeromonas）的相對豐度與TAG含量呈顯著正相關(guān)，而梭桿菌門（Fusobacteriota）和梭桿菌屬（Cetobacterium）的相對豐度與肝臟甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步驗證Cetobacterium、Plesiomonas和Aeromonas的豐度與肝臟TAG含量的關(guān)系，收集了斑馬魚和鯉魚的公共數(shù)據(jù)集。Spearman相關(guān)分析顯示，Cetobacterium與肝臟TAG含量呈一致的顯著負(fù)相關(guān)，而Plesiomonas和Aeromonas則沒有。

對C.?SOMERAE的基因組與生長分析揭示其代謝甘露糖的能力

為探究甘露糖補(bǔ)充后腸道中這些不同細(xì)菌類群豐度變化的原因，該團(tuán)隊對斑馬魚腸道中選定的菌株進(jìn)行了全基因組測序分析，包括C.?somerae?XMX-1,?Plesiomonas?shigelloides?CB5?和Aeromonas?veronii??XMX-5。結(jié)果證實這些菌株存在顯著的功能差異。

首先，三種菌株的基因組結(jié)構(gòu)存在明顯差異。由于甘露糖喂養(yǎng)的斑馬魚腸道中Cetobacterium相對豐度較高，進(jìn)一步比較了這三種細(xì)菌對單糖代謝途徑的差異。結(jié)果顯示，只有C.somerae具有代謝甘露糖的能力，進(jìn)一步的生長實驗證實C.somerae可利用甘露糖作為其生長的主要碳源。相比之下，當(dāng)甘露糖作為主要碳源時，P.shigelloides?CB5和A.veronii?XMX?-5均未觀察到生長。

腸道C.?SOMERAE可減少斑馬魚肝臟脂肪蓄積

為明確甘露糖或C.?somerae是否能減少肝臟脂肪積累，研究了甘露糖對無菌（GF）斑馬魚肝臟脂肪積累的直接影響。結(jié)果證實，補(bǔ)充甘露糖的飲食并未減少肝臟脂肪積累，且與脂質(zhì)代謝和炎癥因子相關(guān)的基因表達(dá)未出現(xiàn)顯著變化。

然而，甘露糖改善的腸道菌群可減少斑馬魚肝臟脂肪積累。隨后，為直接驗證C.?somerae補(bǔ)充對降低肝臟脂質(zhì)積累的影響，在喂食HFD的GF斑馬魚幼體中添加了濃度為106?CFUs/g的C.?somerae。與HFD組相比，補(bǔ)充C.?somerae的組別肝臟TAG含量和油紅染色顯著降低。C.?somerae對宿主的保護(hù)作用已在脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)基因中得到證實。

此外，團(tuán)隊評估了P.?shigelloides?CB5或A.?veronii?XMX-5對肝臟降脂效果，證實這些菌株不影響斑馬魚肝臟脂肪含量。最后，發(fā)現(xiàn)C.?somerae可改善斑馬魚肝臟脂肪積累和腸道健康。

代謝組與基因組分析揭示了C.?SOMERAE中精氨酸-腐胺通路的存在

為探究C.?somerae可HFD下改善宿主肝臟健康的機(jī)制，結(jié)合基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析以及同位素示蹤方法，來確定C.?somerae參與降低肝臟脂肪含量的活性成分。代謝組分析顯示，無菌培養(yǎng)基和C.?somerae上清液中的代謝物顯著分離，且組內(nèi)差異性較低。差異代謝物分析表明，腐胺是C.?somerae上清液中最豐富的代謝物之一。隨后團(tuán)隊基于C.?somerae的基因組序列注釋了腐胺代謝途徑中的主要酶，并發(fā)現(xiàn)C.?somerae擁有編碼精氨酸脫羧酶的基因，以及胍丁胺脫亞胺酶和N-氨甲酰腐胺酰胺酶的基因，從而從胍基丁胺中產(chǎn)生腐胺，這與其他細(xì)菌的研究結(jié)果一致。

此外，C.?somerae的全譜代謝組分析顯示，該細(xì)菌可利用精氨酸產(chǎn)生胍基丁胺并進(jìn)一步產(chǎn)生腐胺。進(jìn)一步的靶向代謝組分析表明，精氨酸在48小時被C.?somerae完全利用，腐胺含量達(dá)到2.22?μmol/mL。為驗證該代謝途徑在C.?somerae中的存在，我們在培養(yǎng)基中添加了外源性同位素標(biāo)記的13C6?15N4-精氨酸。結(jié)果顯示，C.?somerae的上清液和細(xì)菌沉淀中均檢測到13C4?15N2-腐胺。最后，通過向培養(yǎng)基中補(bǔ)充D8-腐胺，驗證C.?somerae是否能進(jìn)一步代謝腐胺生成亞精胺。結(jié)果表明，C.?somerae的上清液和細(xì)菌沉淀中均檢測到D8-腐胺，但未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的亞精胺。綜合分析表明，C.?somerae可通過精氨酸代謝途徑產(chǎn)生腐胺，該代謝物可能具有降低肝臟脂質(zhì)的潛在作用。

圖2-亞精胺是改善HFD誘導(dǎo)性肝脂肪變性的效應(yīng)分子

腐胺對肝功能無直接影響，但其下游宿主代謝產(chǎn)物精脒可緩解脂肪肝病理改

亞精胺作為腐胺的下游代謝產(chǎn)物，已被證實可緩解肝臟脂肪變性，但未在C.somerae基因組中發(fā)現(xiàn)亞精胺合成酶（srm）基因，且在細(xì)菌上清液中也未檢測到該酶。此外，在C.somerae培養(yǎng)物的任何組分中均未檢測到13C415N2-亞精胺到D8-亞精胺。檢測了斑馬魚基因組，發(fā)現(xiàn)其確實存在可將腐胺代謝為亞精胺的亞精胺合成酶（EC:2.5.1.16）基因。采用斑馬魚肝臟（ZFL）細(xì)胞模型進(jìn)行的同位素示蹤實驗顯示，?ZFL?細(xì)胞中檢測到總亞精胺中有57.78%為D8-亞精胺，表明?ZFL?細(xì)胞能夠?qū)8-腐胺代謝D8-亞精胺。

隨后研究團(tuán)隊通過ZFL的HFD模型驗證腐胺和亞精胺是否會影響肝臟脂質(zhì)代謝。與對照組相比，腐胺和亞精胺處理的?ZFL?細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量顯著降低。為驗證亞精胺對肝功能的影響，在ZFL細(xì)胞和斑馬魚幼體中敲低了亞精胺合成酶。沉默亞精胺合成酶后，腐胺處理組的降脂效果消失，而亞精胺處理組仍保持該效應(yīng)。

HFD斑馬魚中腐胺-亞精胺交叉對話的發(fā)現(xiàn)

為驗證腸道微生物產(chǎn)生的腐胺是否可轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟作為亞精胺合成的前體，體內(nèi)同位素示蹤實驗顯示：腸道中的D8-腐胺可通過血液轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，且肝臟可將84.50%的D8-腐胺代謝為D8-亞精胺，肝臟中亞精胺含量顯著高于腐胺。通過斑馬魚HFD模型進(jìn)一步驗證了腐胺與亞精胺的降脂作用：與HFD組相比，腐胺和亞精胺處理組的肝臟甘油三酯含量均顯著降低；兩組肝臟中腐胺與亞精胺水平均恢復(fù)至正常水平。補(bǔ)充甘露糖和C.?somerae的實驗組亦證實此結(jié)果，表明肝臟是腐胺轉(zhuǎn)化為亞精胺的主要代謝場所。

研究總結(jié)

該研究發(fā)現(xiàn)了一種涉及精氨酸-腐胺-亞精胺級聯(lián)代謝途徑的新機(jī)制，該機(jī)制通過腸道C.?somerae與宿主肝臟的協(xié)同作用改善肝臟脂肪變性。關(guān)于腸道-肝臟軸中微生物-宿主代謝相互作用產(chǎn)生有用代謝物亞精胺的新發(fā)現(xiàn)，提出了腸道-肝臟軸中宿主-微生物交叉對話的新概念。

研究背景

細(xì)胞自噬是一種非常保守的細(xì)胞內(nèi)降解系統(tǒng)，近期的研究表明小鼠中細(xì)胞自噬現(xiàn)象表現(xiàn)出了生物鐘節(jié)律，nr1d1基因缺陷能導(dǎo)致小鼠骨骼肌中自噬活動的紊亂。然而生物鐘調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的機(jī)理還不清楚。斑馬魚的細(xì)胞自噬活動是否表現(xiàn)出生物鐘節(jié)律還沒有報道，本研究旨在以斑馬魚為實驗材料研究nr1d1基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的生物鐘節(jié)律方面的作用。

實驗設(shè)計

實驗材料：2種材料：野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚
2個時間點(diǎn)：CT2和CT14（分別為受精后122和134小時）;
無生物學(xué)重復(fù)
測序方法：百邁客Illumina HiSeq2000 PE125

結(jié)果展示

1.表型描述及關(guān)鍵基因在幼魚和肝臟中的表達(dá)情況

首先用TEM（透射電鏡）對一天內(nèi)不同時間（ZT0，ZT6，ZT12，ZT18）的肝臟切片進(jìn)行觀察，統(tǒng)計一天內(nèi)自噬體數(shù)量的變化（紅色箭頭處，圖1，A），并進(jìn)行統(tǒng)計（圖1，B），研究表明斑馬魚肝臟內(nèi)自噬體的數(shù)量符合生物鐘節(jié)律。

TEM觀測及自噬體數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果

選取了幾個以前研究過的與自噬體形成、移動、延伸、融合、降解有關(guān)的基因進(jìn)行RT-PCR分析，如maplc3b，bnip3，becn1等。材料為受精后72-96小時的斑馬魚幼體和肝臟材料。由圖可見這些基因都表現(xiàn)出明顯的生物鐘節(jié)律。圖中白色底色表示白天，灰色底色表示黑夜。

圖2 關(guān)鍵基因的RT-PCR檢測

2.用TALEN技術(shù)構(gòu)建nrid1突變斑馬魚，并進(jìn)行表型研究和關(guān)鍵基因表達(dá)分析

用TEM觀察WT和nr1d1突變斑馬魚肝臟中的自噬體數(shù)量，研究表明自噬體數(shù)量在nr1d1中明顯高于WT。

圖3 不同樣品斑馬魚肝臟自噬體觀測及統(tǒng)計

用RT-PCR研究在WT和nr1d1突變斑馬魚中關(guān)鍵基因的表達(dá)差異，nr1d1突變體中基因表達(dá)模式與WT中明顯不同。

圖4 差異基因的RT-PCR驗證

3.用ChIP和熒光素酶研究Nr1d1直接調(diào)控的下游基因

體外熒光素酶實驗表明Nr1d1蛋白能直接結(jié)合ulk1a基因的promoter區(qū)域，體內(nèi)ChIP實驗進(jìn)一步證明Nr1d1蛋白能夠結(jié)合ulk1a基因的promoter區(qū)域。說明Nr1d1能直接調(diào)控ulk1a基因的表達(dá)。

圖5 熒光素和chip結(jié)果

4. 野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚轉(zhuǎn)錄組分析

為了進(jìn)一步說明nr1d1基因的功能，文章選取了野生型WT和nr1d1突變型斑馬魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，并且取了2個時間點(diǎn)（CT2和CT14）。研究表明在CT2階段兩者有975個差異表達(dá)基因，在CT14階段有1360個差異表達(dá)基因。與WT相比，在nr1d1突變體中上調(diào)的基因數(shù)量要大于下調(diào)的基因數(shù)量。

同時，選取部分關(guān)鍵的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-PCR驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。

圖6 差異基因韋恩圖

圖7 差異基因聚類圖

圖8 關(guān)鍵基因的RT-PCR驗證

研究結(jié)論

通過研究WT野生型和nr1d1突變型斑馬魚的基因表達(dá)情況，表明Nr1d1基因在生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬過程中起著重要作用。生物鐘相關(guān)基因直接受Nr1d1調(diào)控。此外，通過轉(zhuǎn)錄組分析表明Nr1d1還調(diào)控脅迫、代謝、信號傳導(dǎo)、翻譯后修飾等生理過程。

圖9 Nr1d1在生物鐘和細(xì)胞自噬過程中的作用模式圖

亮點(diǎn)

1.首次利用斑馬魚研究生物鐘和細(xì)胞自噬的關(guān)系；
2.發(fā)現(xiàn)Nr1d1在生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬過程中的關(guān)鍵作用；
3.轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)一步證明Nr1d1的作用，并揭示Nr1d1其它生理功能。
4.雖然轉(zhuǎn)錄組的內(nèi)容在這篇文章中比重不大，但卻揭示了除了生物鐘調(diào)節(jié)和細(xì)胞自噬，Nr1d1基因還有很多其它的功能，顯著提升了文章的水平，并為后續(xù)研究打好了基礎(chǔ)。