該研究系統(tǒng)繪制了陸地棉進(jìn)化路線圖，并揭示了染色體大尺度變異如何調(diào)控種群遺傳多樣性和環(huán)境適應(yīng)性的遺傳機(jī)制。這一研究不僅挖掘出纖維品質(zhì)改良的關(guān)鍵遺傳靶點(diǎn)，還為創(chuàng)造優(yōu)異的棉花種質(zhì)開(kāi)辟了新的路徑。百邁客生物為該研究提供了基因組測(cè)序、組裝服務(wù)！

研究背景

棉花是全球性重要經(jīng)濟(jì)作物，既是紡織工業(yè)的核心原料，也兼具重要的油用和飼用價(jià)值。我國(guó)作為全球最大的原棉生產(chǎn)國(guó)、消費(fèi)國(guó)、進(jìn)口國(guó)和紡織品服裝出口國(guó)，棉花產(chǎn)業(yè)在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中的地位舉足輕重。

然而，長(zhǎng)期區(qū)域化集中種植和人工選擇導(dǎo)致陸地棉遺傳多樣性嚴(yán)重降低、品種同質(zhì)化問(wèn)題日益加劇，疊加極端氣候頻發(fā)與病蟲(chóng)害壓力，給棉花穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)和持續(xù)育種創(chuàng)新帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。系統(tǒng)解析陸地棉馴化與環(huán)境適應(yīng)的分子演化軌跡，深入挖掘種質(zhì)資源中尚未被充分利用的優(yōu)異遺傳位點(diǎn)，是破解上述瓶頸的關(guān)鍵。

研究?jī)?nèi)容

從野生到栽培：結(jié)構(gòu)變異揭示陸地棉的演化路徑與馴化代價(jià)

研究團(tuán)隊(duì)基于107份陸地棉代表性種質(zhì)構(gòu)建高質(zhì)量泛基因組，系統(tǒng)解析了其基因組結(jié)構(gòu)與演化特征。首次精細(xì)描繪了5S和45S?核糖體DNA（rDNA）的高度復(fù)雜組織，發(fā)現(xiàn)5S?rDNA序列多樣性顯著高于已報(bào)道作物；同時(shí)揭示了LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在染色體上的區(qū)室化分布特征，其中Athlia亞族的插入可追溯至約400萬(wàn)年前。功能分析表明，盡管可變基因家族在數(shù)量上占據(jù)優(yōu)勢(shì)，但核心基因卻主導(dǎo)基礎(chǔ)細(xì)胞生命過(guò)程，可變基因則富集于脂質(zhì)與甾醇代謝等適應(yīng)性相關(guān)通路。

尤為重要的是，通過(guò)比較半野生種與栽培種發(fā)現(xiàn)，半野生棉特有基因顯著富集于防御相關(guān)激素通路且保持較高頻率，而栽培棉中約65%的特有基因?yàn)榈皖l等位基因（≤5%）。分析發(fā)現(xiàn)馴化過(guò)程中部分抗逆遺傳潛力被削弱，同時(shí)人工選擇促進(jìn)了稀有有利變異的保留與積累，研究結(jié)果為突破當(dāng)前品種同質(zhì)化瓶頸提供了關(guān)鍵遺傳資源與理論依據(jù)。

圖1 5S rDNA和45S rDNA分析

研究首次在陸地棉種內(nèi)鑒定到A03與A09染色體間的大尺度相互易位。該結(jié)構(gòu)變異起源于野生群體，并在加勒比海岸的地方種中高頻固定（96.3%），而在中美洲地方種（僅17.4%）和現(xiàn)代栽培品種中幾乎缺失（0%）。該易位類(lèi)型明顯不同于其他異源四倍體棉種（AD2–AD7）及典型陸地棉材料（如N244）的祖先染色體構(gòu)型。此類(lèi)染色體結(jié)構(gòu)變異清晰地揭示陸地棉馴化過(guò)程中存在兩個(gè)獨(dú)立的遺傳多樣性中心——加勒比海岸與中美洲，且表明現(xiàn)代栽培種主要繼承來(lái)自中美洲譜系，而加勒比海岸特有的染色體結(jié)構(gòu)在馴化過(guò)程中被丟失。

圖2 A03-A09易位的鑒定及驗(yàn)證

進(jìn)一步研究表明，在栽培陸地棉形成之前，野生/半野生陸地棉曾經(jīng)歷三個(gè)階段的結(jié)構(gòu)變異積累。以這些結(jié)構(gòu)變異為遺傳標(biāo)記，可將陸地棉劃分為32種單倍型，而現(xiàn)代栽培種僅來(lái)源于其中一個(gè)單倍型，遺傳基礎(chǔ)極為狹窄。基于上述研究成果，團(tuán)隊(duì)在基因組層面重構(gòu)了陸地棉從“尤卡坦半島起源→危地馬拉擴(kuò)散→全球傳播”的三階段馴化與傳播路徑。

圖3 陸地棉三段式馴化路徑

陸地棉在馴化與擴(kuò)散過(guò)程中并非孤立演化，而通過(guò)與海島棉多次自然雜交，持續(xù)引入外源遺傳物質(zhì)。這些來(lái)源于種間漸滲的基因組片段廣泛分布于全基因組中，其長(zhǎng)度顯著超出既往認(rèn)知范圍，并顯著富集于功能活躍區(qū)域，尤其與開(kāi)花時(shí)間等關(guān)鍵適應(yīng)性性狀密切相關(guān)。進(jìn)一步的地理分布與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，加勒比海岸及中美洲地區(qū)是種間基因流動(dòng)的熱點(diǎn)區(qū)域，而現(xiàn)代栽培棉可能通過(guò)繼承特定的漸滲組合以獲得新環(huán)境適應(yīng)能力。

圖4 陸地棉半野生棉及栽培種中海島棉漸滲片段分析

基因?qū)殻航Y(jié)構(gòu)變異揭示“隱藏”的抗病與高產(chǎn)密碼

研究還揭示陸地棉泛基因組中廣泛存在與抗病密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)變異，尤其在NLR基因富集區(qū)域形成高度動(dòng)態(tài)的“可變熱點(diǎn)”。在馴化過(guò)程中，栽培棉顯著丟失了NLR多樣性，但部分關(guān)鍵亞家族（如CNL）兼具核心保守性與結(jié)構(gòu)可塑性，可能為其持續(xù)的抗病適應(yīng)能力提供支撐。基于存在/缺失變異（PAV）的GWAS不僅驗(yàn)證了已知抗黃萎病位點(diǎn)VWA10，還鑒定到新抗性位點(diǎn)VWD11，其抗性單倍型與一個(gè)受病原誘導(dǎo)表達(dá)的TNL基因緊密關(guān)聯(lián)。該位點(diǎn)在黃河流域棉區(qū)顯著富集，且在育種進(jìn)程中抗性持續(xù)增強(qiáng)，并伴隨TIR結(jié)構(gòu)域多樣性提升，提示在長(zhǎng)期病原壓力下信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊發(fā)生了功能分化。

圖5 陸地棉泛NLR分析

利用陸地棉核心種質(zhì)群體開(kāi)展了PAV-GWAS，共鑒定出69個(gè)與纖維品質(zhì)和衣分相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，其中62個(gè)為傳統(tǒng)SNP-GWAS無(wú)法檢測(cè)的新位點(diǎn)，凸顯了PAV在挖掘“隱藏”遺傳變異方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。整合eQTL分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)PAV直接調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)，例如D02染色體上鑒定到的一個(gè)新QTL通過(guò)85?bp缺失和103?bp插入共同調(diào)控基因N244D02G000230，從而影響衣分性狀；值得注意的是，其低衣分但高黃萎病抗性的Hap.A單倍型在現(xiàn)代中國(guó)主栽品種中頻率顯著上升，反映了育種中對(duì)抗性與產(chǎn)量的權(quán)衡選擇。此外，在A07染色體鑒定到一個(gè)同時(shí)調(diào)控纖維強(qiáng)度與種子大小的多效性PAV位點(diǎn)，其806bp插入導(dǎo)致WD40類(lèi)基因N244A07G024740內(nèi)含子延長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)該基因可促進(jìn)種子發(fā)育。研究還揭示PAV區(qū)域內(nèi)部基因整體表達(dá)偏低，但部分特有基因（如遠(yuǎn)緣雜交材料中的CesA7）對(duì)纖維品質(zhì)提升具有關(guān)鍵作用。

圖6?PAV-GWAS揭示“隱藏”的QTL

倒位育種：機(jī)遇與連鎖累贅

研究還系統(tǒng)繪制了陸地棉中127個(gè)大尺度倒位的全基因組分布圖譜，揭示其在抗蟲(chóng)性與纖維色澤等重要性狀中的關(guān)鍵作用。在A06染色體上，一個(gè)3.9?Mb的倒位顯著提升葉片表皮毛密度（與抗蟲(chóng)相關(guān)），并進(jìn)一步鎖定候選基因?N244A06G021950；而在A07染色體，Lc1位點(diǎn)所決定的棕色纖維表型由兩種不同的倒位單倍型控制，其通過(guò)調(diào)控類(lèi)黃酮通路核心基因?GhTT2?的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)纖維顏色的梯度變化。值得注意的是，這兩個(gè)功能倒位均與區(qū)域內(nèi)數(shù)百個(gè)基因緊密連鎖，導(dǎo)致在選擇高抗蟲(chóng)性或理想纖維色澤時(shí)，可能無(wú)意中引入大量非目標(biāo)性狀基因即“連鎖累贅”。這一發(fā)現(xiàn)不僅揭示了傳統(tǒng)育種中性狀改良所面臨的潛在代價(jià)，也提出在泛基因組時(shí)代亟需結(jié)合結(jié)構(gòu)變異精細(xì)圖譜，發(fā)展“打破不利連鎖、實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)編輯”的新策略，以充分釋放倒位所攜帶的育種潛力。

圖7 陸地棉倒位變異圖譜的構(gòu)建

研究總結(jié)

綜上所述，該研究不僅為理解陸地棉的進(jìn)化歷程提供了寶貴的信息，也為未來(lái)棉花品種改良指明了方向。通過(guò)整合多方面的研究成果，團(tuán)隊(duì)成功重構(gòu)了陸地棉從尤卡坦半島起源到危地馬拉擴(kuò)散再到全球傳播的三階段馴化與傳播路徑。同時(shí)，研究還強(qiáng)調(diào)了種間漸滲的重要性，指出它為現(xiàn)代栽培棉帶來(lái)了新環(huán)境適應(yīng)能力。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于提高棉花產(chǎn)量和質(zhì)量，應(yīng)對(duì)氣候變化和病蟲(chóng)害挑戰(zhàn)具有重要意義。最后，研究團(tuán)隊(duì)提出結(jié)合結(jié)構(gòu)變異精細(xì)圖譜發(fā)展“打破不利連鎖、實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)編輯”的新策略，以充分釋放倒位所攜帶的育種潛力。

以上內(nèi)容來(lái)源于iPlants，侵刪

棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在2018年5月8日中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所所長(zhǎng)李付廣研究員、武漢大學(xué)朱玉賢院士、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所杜雄明研究員、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所所長(zhǎng)黃三文研究員、林濤博士與北京百邁客生物科技有限公司關(guān)于亞洲棉的合作成果發(fā)表在Nature Genetics上，論文題目為“Resequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits”。該研究以全新亞洲棉基因組為基礎(chǔ)，增加遺傳進(jìn)化和GWAS研究，對(duì)棉的品質(zhì)、產(chǎn)量、抗病等重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行研究。其中朱玉賢院士與李付廣研究員為通訊作者，杜雄明研究員為第一作者。

以下為文獻(xiàn)詳細(xì)解讀：

英文題目：Sequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated A genome identifies the genetic basis of key agronomic traits.

中文題目：以更新的亞洲棉A基因組為基礎(chǔ)的243份二倍體棉花的重要農(nóng)藝性狀的研究

1. 摘要

亞洲棉（Gossypium arboreum）和草棉（Gossypium herbaceum）的祖先是現(xiàn)代栽培異源四倍體棉花A亞基因組的供體。本研究中通過(guò)整合了不同的技術(shù)，提升了亞洲棉的基因組組裝水平；同時(shí)對(duì)243株二倍體棉花（亞洲棉和草棉）進(jìn)行全基因組重測(cè)序分析，繪制基因組變異圖譜，并發(fā)現(xiàn)亞洲棉和草棉（A）與雷蒙德氏棉（D）同時(shí)進(jìn)行了分化；單獨(dú)的對(duì)亞洲棉分析表明亞洲棉起源于中國(guó)南部，隨后被引入長(zhǎng)江和黃河地區(qū)，大多數(shù)具有馴化相關(guān)特性的種質(zhì)都經(jīng)歷了地理隔離；通過(guò)亞洲棉的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS），鑒定了亞洲棉11個(gè)重要農(nóng)藝性狀的98個(gè)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，GaKASIII的非同義替換（半胱氨酸/精氨酸替換）使得棉籽中的脂肪酸組成（C16:0和C16:1）發(fā)生了變化；棉花枯萎病抗性與GaGSTF9基因的表達(dá)激活相關(guān)。本研究對(duì)理解棉花A亞基因組的進(jìn)化具有重要的意義。

2. 研究背景

棉花是世界上最重要的商業(yè)作物之一，同時(shí)也是研究植物多倍化的有價(jià)值的資源。亞洲棉最可能在馬達(dá)加斯加或印度河流域文明（巴基斯坦摩亨佐達(dá)羅）開(kāi)始馴化，隨后分散到非洲和亞洲一些地區(qū)。亞洲棉最初在1000多年前作為觀賞植物引入中國(guó)。當(dāng)?shù)胤降霓r(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)和人類(lèi)選擇影響的過(guò)程中，中國(guó)的Gossypium arboreum形成了獨(dú)特的地理種群，稱(chēng)之為“sinense cotton”。

雖然棉花種植者已經(jīng)基于RFLP和SSR markers構(gòu)建了各種遺傳圖譜，但是G. arboreum和G. herbaceum優(yōu)良農(nóng)藝和經(jīng)濟(jì)性狀的基因尚未被鑒定。同樣通過(guò)種內(nèi)和種間特異性雜交將二倍體的重要特性引入四倍體并不是富有成效的，G. raimondii，G. arboreum，G. hirsutum和G. barbadense基因組序列的發(fā)布為研究群體遺傳，栽培和馴化提供了先決條件。通過(guò)GWAS和QTLs在水稻，玉米，大豆，谷子，黃瓜，番茄和陸地棉中鑒定了許多候選基因。本研究中，利用了三代PacBio和Hi-C技術(shù)，重新組裝了高質(zhì)量的亞洲棉基因組，分析了243份二倍體棉花種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)和基因組分化趨勢(shì)，同時(shí)確定了一些有助于棉花皮棉產(chǎn)量遺傳改良的候選基因位點(diǎn)。

3. 材料和方法

測(cè)序材料：

基因組測(cè)序材料：二倍體G. arboreum栽培品種cultivar Shixiya1（SXY1）；

自然群體材料選擇：243份棉花，包含230份亞洲棉 G. arboretum 和13份草棉 G. herbaceum [243份棉花選自國(guó)家種質(zhì)基因庫(kù)（中國(guó)安陽(yáng)），種植在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（ICR，CAAS）的溫室中]，插入片段長(zhǎng)度500 bp；測(cè)序深度6X；

遺傳群體材料選擇：親本（GA0146和GA0149），測(cè)序深度20X；2個(gè)混池（F2群體，有絨型和無(wú)絨型各20個(gè)子代），測(cè)序深度30X；

群體材料表型調(diào)查：在230份亞洲棉中選擇了215份表型穩(wěn)定的材料，分別在河南安陽(yáng)，海南三亞和新疆阿克蘇進(jìn)行種植，大部分性狀選自多年多點(diǎn)的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)查，每個(gè)地點(diǎn)設(shè)置3次重復(fù)。

測(cè)序平臺(tái)：PacBio RSII和Illumina HiSeq 2500

相關(guān)軟件：基因組組裝（Canu和Falcon；Quiver；Pbjelly）；TEs轉(zhuǎn)座元件注釋?zhuān)≧epeatScout，LTR-FINDER，MITE和PILER；Repbase；REPET；RepeatMasker）；基因預(yù)測(cè)注釋?zhuān)╣eMoMa；Augustus；PASA；EVidenceModeler；InterProScan）

群體研究：比對(duì)注釋?zhuān)˙WA，Picard，GATK，ANNOVAR）；群體結(jié)構(gòu)分析（FastTree，PHYLIP，STRUCTURE）；連鎖不平衡分析（Haploview）；遺傳多樣性分析（π，F(xiàn)st）；全基因組關(guān)聯(lián)分析（EMMAX）；

4. 研究結(jié)果

1. 亞洲棉基因組組裝更新

三代+Hi-C：PacBio reads ?（77.6×）；有效Hi-C reads（＞20×）
三代組裝結(jié)果：共計(jì)獲得了142.54 Gb ?原始三代測(cè)序數(shù)據(jù)，組裝1.71 Gb亞洲棉基因組，Contig N50=1.1 Mb，最長(zhǎng)的Contig為12.37 Mb
（1）Hi-C輔助基因組組裝：利用Hi-C技術(shù)將組裝的1573 Mb的數(shù)據(jù)定位到13條染色體上，與已經(jīng)發(fā)表的基因組相比，當(dāng)Hi-C數(shù)據(jù)比對(duì)到更新的基因組后，對(duì)角線外的不一致性明顯減少（圖1 a-b）。

圖1 Hi-C數(shù)據(jù)在兩版亞洲棉基因組上的比對(duì)

a. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉原基因組比對(duì)；b. Hi-C數(shù)據(jù)與亞洲棉更新基因組比對(duì)
（2）基因組共線性分析：進(jìn)行了亞洲棉A型與異源四倍體陸地棉的AADD型的共線性分析，發(fā)現(xiàn)更新后的基因組的共線性更高（圖2 a-b）。

圖2 亞洲棉（AA型）與陸地棉（AADD型）共線性分析

a. 亞洲棉原基因組與陸地棉基因組共線性分析；b. 亞洲棉更新基因組與陸地棉基因組共線性分析
（3）亞洲棉原基因組（二代）與更新后基因組（三代）比較（表1）：
表1 亞洲原基因組與更新后基因組的組裝指標(biāo)比較

2. 二倍體棉花群體遺傳進(jìn)化分析

（1）二倍體棉花群體材料選擇
共計(jì)選擇了243份二倍體棉花材料：230份亞洲棉G. arboreum (A2) ?和13份草棉G. herbaceum (A1)；材料來(lái)源：中國(guó)南部(SC)，長(zhǎng)江(YZR)和黃河（這些區(qū)域代表了中國(guó)二倍體棉花大部分的表型和地理多樣性）。

圖3 亞洲棉的地理分布

（2）群體重測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
通過(guò)重測(cè)序的研究策略，利用Illumina HiSeq 2500 ?測(cè)序平臺(tái)，PE125雙端測(cè)序，共計(jì)獲得了2.29 T數(shù)據(jù)，平均測(cè)序深度~6.0×，以本研究中更新后的亞洲棉基因組為參考基因組進(jìn)行比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)獲得了17,883,108個(gè)高質(zhì)量SNPs和2,470,515個(gè)indels，242,449 個(gè)SNPs（1.36%）和16,816個(gè)indels（0.68%）位于亞洲棉36,205個(gè)基因的編碼區(qū)。在31,549個(gè)基因中，共計(jì)鑒定了128,512（0.72%）個(gè)非同義突變SNPs，在8,117個(gè)基因中共計(jì)鑒定了11,372 (0.46%)個(gè)indels。

（3）二倍體棉花群體分層分析
以雷蒙德氏棉（G. raimondii）為外群，利用72,419個(gè)SNPs構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，顯示：G. herbaceum（草棉）和G. arboretum（亞洲棉）聚類(lèi)成2個(gè)獨(dú)立的群（圖4 a-b）。G. arboretum（亞洲棉）進(jìn)一步又分為SC，YZR和YER三個(gè)群，顯示了地理分布模式的差異，進(jìn)而利用PCA分析支持這一結(jié)果（圖4 c）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了亞洲棉和草棉是由不同的祖先種馴化而形成。

圖4 二倍體棉花的群體分層分析

a. 243份二倍體棉花系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) b. 243份二倍體棉花的群體結(jié)構(gòu)分析 c. PCA主成分分析（中國(guó)亞洲棉的PCA分析；亞洲棉和草棉的PCA分析）

（4）二倍體棉花LD和選擇性清除分析
通過(guò)表型計(jì)算統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與長(zhǎng)江和黃河區(qū)域的兩個(gè)不同地區(qū)的材料項(xiàng)目，中國(guó)南部的材料的表型相對(duì)匱乏。此外中國(guó)南部SC的亞洲棉（π=0.211×10-3）比長(zhǎng)江流域YZR（π=0.197×10-3）和黃河流域YER（π=0.199×10-3）的亞洲棉的核苷酸多態(tài)性高，這表明了亞洲棉較早在中國(guó)南部地區(qū)種植，并進(jìn)一步擴(kuò)展到長(zhǎng)江和黃河地區(qū)，而這與之前基于SSR分析的結(jié)果一致；連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，亞洲棉的LD衰減距離約為105.5 kb（r2=0.40），草棉的衰減距離約為145.5 kb（r2=0.39）（圖5），其LD衰減距離與大豆（約83 kb）和水稻（秈稻約123 kb；粳稻約167 kb）接近，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于栽培玉米（22-30 kb）。大約有23.9％的亞洲棉和22.9％的草棉的等位基因與雷蒙德氏棉的基因組相一致，暗示了亞洲棉與草棉同時(shí)開(kāi)始分化（圖6）。

圖5 連鎖不平衡分析? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖6 棉屬的系統(tǒng)發(fā)育與等位基因分析

人工選擇在農(nóng)作物的馴化和遷徙的過(guò)程中具有重要的作用。群體結(jié)構(gòu)分析顯示當(dāng)K=4時(shí)，YER與SC和YZR明顯不同（圖4 b，K=4）。通過(guò)兩兩群體間（SC vs. YZR, SC vs. YER, YZR vs. YER）的選擇性清除分析（FST）鑒定出了分別覆蓋到3,162，2,879和3,308個(gè)基因上的59，53和51個(gè)顯著遺傳分化的區(qū)域。SC和YZR之間的21個(gè)分化的區(qū)域（約43.5 Mb 含有915個(gè)基因）在群體SC和YER之間是保守的（圖7 a）。

圖7 a. 亞洲棉SC，YZR和YER的選擇性清除分析；b. 全基因組關(guān)聯(lián)分析

3. 亞洲棉的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）

對(duì)來(lái)自不同環(huán)境下的11個(gè)重要性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在98個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的信號(hào)中，其中25信號(hào)個(gè)來(lái)自基因區(qū)（外顯子或內(nèi)含子區(qū)），包含與形態(tài)性狀相關(guān)的8個(gè)信號(hào)區(qū)，與產(chǎn)量性狀相關(guān)的6個(gè)信號(hào)區(qū)，與油籽性狀相關(guān)的3個(gè)信號(hào)區(qū)；剩余73個(gè)信號(hào)來(lái)自非編碼區(qū)。大部分農(nóng)藝性狀的GWAS關(guān)聯(lián)信號(hào)中顯示地理差異，如交配分支數(shù)，開(kāi)花期，鈴重和抗病性這些性狀定位在保守的基因區(qū)（圖7 b，表2）。因此推斷成熟度，產(chǎn)量和抗病性這些性狀一直處于強(qiáng)烈的認(rèn)為和/或地理選擇之下。

表2 部分與性狀關(guān)聯(lián)的SNPs及候選基因

（1）脂肪酸含量相關(guān)基因的定位與研究 棉花是世界上第六大植物油來(lái)源，通過(guò)GWAS關(guān)聯(lián)分析，在11號(hào)染色體上的GaKASIII基因組座位上(Ga11G3851)的第8個(gè)外顯子區(qū)獲得了1個(gè)顯著的SNP位點(diǎn)，該基因編碼3-Oxoacyl-[acyl-carrier-protein ACP] synthase III（3-氧酰基-[酰載體蛋白]合酶III），如圖8 a-c，KASIII基因編碼的這一關(guān)鍵酶可以使得脂肪酸鏈從C2到C4延伸，并最終確定種子中棕櫚酸（C16：0）和棕櫚油酸（C16：1）的組成。GaKASIII基因的多態(tài)性導(dǎo)致了保守的ACP_synthase_III_（酰載體蛋白合酶III）結(jié)構(gòu)域中半胱氨酸/精氨酸間的置換（圖8 c），單倍型B（TGT，Cys）主要出現(xiàn)在低含油量種質(zhì)中，而在高含油量種質(zhì)中發(fā)現(xiàn)單倍型A（CGT，Arg）（圖8 d-e）。GaKASIII基因在開(kāi)花后（DPA）的30天表達(dá)量最高（圖9），這是種子油量積累的關(guān)鍵階段，在單倍型種質(zhì)A中，C16：0和C16：1含量以顯著的速率累積（圖10）；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)顯示，半胱氨酸/精氨酸殘基位于α螺旋處，該位點(diǎn)靠近酶活性位點(diǎn)，同時(shí)是輔酶A（CoA）結(jié)合位點(diǎn)（圖11）。

圖8 脂肪酸含量GWAS關(guān)聯(lián)分析

a. 棕櫚酸含量的GWAS關(guān)聯(lián)分析；b. 棕櫚油酸的GWAS關(guān)聯(lián)分析；c. GaKASIII基因的變異（Arg/Cys）；d-e. Hap. A和Hap. B中棕櫚酸和棕櫚油酸含量比較

圖9 GaKASIII基因在棉花胚珠發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

圖10 在棉花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中C16:0和C16:1脂肪酸含量分析（Hap. A和Hap. B）

圖11 GaKASIII蛋白結(jié)構(gòu)模型

（2）棉花枯萎病抗性相關(guān)基因的研究 棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌萎蔫專(zhuān)化型Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum (FOV)引起的棉花維管束病害，是棉花產(chǎn)量的重要威脅之一。通過(guò)GWAS，進(jìn)行棉花FOV抗性分析，發(fā)現(xiàn)在11號(hào)染色體上獲得了強(qiáng)的關(guān)聯(lián)信號(hào)，其-logP value=8.96（圖12 a）。進(jìn)一步分析表明，關(guān)聯(lián)到的SNP簇位于Ga11G2353基因的上游（圖12 b），該基因與擬南芥GSTF9基因?yàn)橹毕低椿?，GSTF9基因編碼參與植物對(duì)生物和非生物脅迫響應(yīng)的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferases），攜帶疾病易感等位基因‘T’（以紫色顯示）的種質(zhì)主要在SC群體中發(fā)現(xiàn)，所有YER群體材料攜帶耐病等位基因‘C’（以橙色顯示）（圖12 c）。研究發(fā)現(xiàn)GSTF9基因僅在FOV接種到亞洲棉幼苗的耐受系中上調(diào)（圖13），與空載體棉花系（TRV::00）相比，GSTF9基因沉默棉花品系（TRV::GSTF9, the virus-induced gene silencing，VIGS，vector carrying the GSTF9 gene）對(duì)于FOV的接種更加敏感（圖14-15）。此外，TRV::GSTF9植株系與TRV::00植株系相比，TRV :: GSTF9植株系中的真菌DNA的量顯著高于TRV::00植株系，且GST催化活性顯著低于TRV::00植株系（圖16 a-b），表明GaGSTF9基因可能是亞洲棉FOV抗性的靶標(biāo)。

圖12 亞洲棉FWDI的全基因組關(guān)聯(lián)分析

a. FWDI的GWAS分析；b. GaGSTF9基因結(jié)構(gòu)及附近關(guān)聯(lián)到的SNPs；c. 關(guān)聯(lián)分析群體基因分型 敏感型（紫）；耐受型（橙）

圖13 GaGSTF9基因表達(dá)的qRT-PCR分析

注：根部接種鐮刀霉菌，（高耐受型GA0165，GA0078和GA0190；高敏感型GA0198，GA0035和GA0026）

圖14 不同植株處理后的病癥比較（GA00198，GA0165，TRV::00和TRV::GSTF9，
處理?xiàng)l件：接種水和FOV）

圖15 不同植株處理后的疾病感染指數(shù)比較（GA00198，GA0165，TRV::00和TRV::GSTF9，處理?xiàng)l件：接種FOV）

圖16 a GA00198, GA0165, TRV::00和TRV:GSTF9植株中FOV DNA的相對(duì)含量測(cè)定；b GA00198, GA0165, TRV::00和TRV:GSTF9植株中GST酶活性測(cè)定；

（3）與棉絨相關(guān)基因的研究 棉絨是覆蓋種子表面的短纖維。研究中選擇了亞洲棉種質(zhì)中的158份有絨毛和57份無(wú)絨毛材料進(jìn)行GWAS關(guān)聯(lián)分析，最終在8號(hào)染色體上（?0.6 Mb至?1.3 Mb的區(qū)間內(nèi)）獲得了強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)信號(hào)（圖17 a-b）。QTL分析也同樣定位到8號(hào)染色體上（圖17 c）。通過(guò)有絨毛品系（GA0146）和無(wú)絨毛品系（GA0149）雜交獲得的F2代顯示了有絨毛和無(wú)絨毛的表型分離比為1：3（圖17 d），說(shuō)明了棉絨的生長(zhǎng)是由單基因座控制。研究中進(jìn)而放大了QTL和GWAS的重疊區(qū)，發(fā)現(xiàn)了這個(gè)大約600 kb的區(qū)域包含推測(cè)的10個(gè)蛋白編碼基因（圖17 e）。在這一強(qiáng)烈的信號(hào)區(qū)域（-logP = 18.95）下或附近，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)凱氏帶膜蛋白基因（casparian strip membrane protein genes）。在B-型細(xì)胞周期蛋白上游獲得了1個(gè)信號(hào)，而B(niǎo)-型細(xì)胞周期蛋白之前被報(bào)道過(guò)與毛狀體和纖維發(fā)育有關(guān)。

圖17 棉絨生長(zhǎng)發(fā)育基因的聯(lián)合定位（GWAS+QTL）

a 亞洲棉種子有絨（左）和無(wú)絨（右）表型；b GWAS關(guān)聯(lián)分析；c F2群體QTL分析；d F2群體的構(gòu)建 e GWAS和QTL聯(lián)合分析
亞洲棉在中國(guó)棉花的栽培史上具有重要的作用。本研究揭示了中國(guó)的亞洲棉群體呈現(xiàn)出不同的地理格局，這一觀點(diǎn)與其從中國(guó)的南部到長(zhǎng)江和黃河的引入相一致。幾種表型如產(chǎn)量和抗病性狀在棉花從中國(guó)南部遷徙到長(zhǎng)江再到黃河，經(jīng)歷了顯著的變化，而這一變化受到了當(dāng)?shù)丨h(huán)境和人為選擇的影響。研究中通過(guò)不同種質(zhì)群體的比較，獲得的地理受選擇的基因區(qū)域與QTL重疊區(qū)域是重要的，具高分辨率的遺傳資源，這將極大地促進(jìn)棉花復(fù)雜性狀的改良。此外，研究中確定了GaKASIII基因可以促進(jìn)棉花脂肪酸鏈的延伸和含油量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了2種典型的GaGSTF9基因單倍型啟動(dòng)子與FOV抗性相關(guān)。最后結(jié)合GWAS與QTL共同定位的結(jié)果，鑒定了凱氏帶膜蛋白基因在棉絨細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮功能性的作用。本研究表明地理隔離已經(jīng)影響了SC，YZR和YER群體的遺傳基礎(chǔ)，同時(shí)影響了中國(guó)亞洲棉的抗病性和產(chǎn)量性狀的形成與分布。

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棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，提供了高質(zhì)量的棉纖維用于工業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)使用。不斷增長(zhǎng)的工業(yè)需求給棉花增產(chǎn)提出了更高的要求。單鈴重是重要的產(chǎn)量構(gòu)成因子之一，如何在不降低其他纖維品質(zhì)的前提下提高產(chǎn)量是育種家孜孜以求的目標(biāo)。通過(guò)MAS輔助育種能夠直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇?；谶z傳圖譜的QTL定位研究可以定位到相應(yīng)的功能基因或者與功能基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，因此能極大地促進(jìn)MAS研究。常規(guī)的SSR標(biāo)記很難構(gòu)建飽和的遺傳圖譜，而利用SNP標(biāo)記則可以解決這個(gè)問(wèn)題。利用高通量測(cè)序技術(shù)能夠?qū)θ蚪M開(kāi)發(fā)SNP標(biāo)記，使高密度遺傳圖譜構(gòu)建成為可能。
本研究利用SLAF-seq技術(shù)對(duì)包含196個(gè)子代的陸地棉RIL群體構(gòu)建高密度遺傳圖譜，并結(jié)合多年多點(diǎn)單鈴重的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位。同時(shí)針對(duì)QTL定位區(qū)域進(jìn)行候選基因的挖掘。

材料和方法

本文親本是0-153和sGK9708，0-153纖維品質(zhì)較好，而sGK9708產(chǎn)量潛力高且適應(yīng)性廣。雙親單鈴重性狀差異極顯著。F6:8重組自交系196個(gè)。方法：利用SLAF-seq技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜并進(jìn)行QTL定位。QTL定位軟件：Windows QTL Cartgrapher 2.5。

結(jié)果分析

共獲得443.56M reads共計(jì)87.89GB數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)Q20為82.24%，GC含量為34.47%。親本共開(kāi)發(fā)SLAF標(biāo)簽5.3萬(wàn)個(gè)，深度分別為78.66X和102.13X。子代平均開(kāi)發(fā)5萬(wàn)個(gè)SLAF標(biāo)簽，平均深度為14.5X?；赟LAF標(biāo)簽共開(kāi)發(fā)出160876個(gè)SNP，其中親本中多態(tài)性有23519個(gè)，多態(tài)率為14.62%。適合棉花作圖的SNP標(biāo)記（aaxbb型）18318個(gè)，去除低質(zhì)量、低深度和極顯著偏分離的標(biāo)記后后剩余5521個(gè)SNP用于遺傳圖譜構(gòu)建。構(gòu)建了棉花A基因組和D基因組連鎖群26個(gè)，共3259.37cM的遺傳圖譜，平均圖距0.78cM。其中A基因組包含標(biāo)記3550個(gè)，遺傳距離1838.37個(gè)，D基因組包含標(biāo)記個(gè)1971個(gè)，遺傳距離1971cM。

（1）遺傳圖與棉花物理圖譜共線性分析發(fā)現(xiàn)圖譜覆蓋度良好，絕大多數(shù)的SNP與物理圖譜的共線性良好，相對(duì)于A基因組而言，D基因組的共線性更好。

（2）重組熱點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)26條連鎖群中，21條含有重組熱點(diǎn)區(qū)域，A套中9條LG含有重組熱點(diǎn)，D套中12條LG含有重組熱點(diǎn)。所有LG中，13號(hào)含有重組熱點(diǎn)最多，有196個(gè)。
結(jié)合多年多點(diǎn)的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位，共檢測(cè)到11個(gè)不同環(huán)境下146個(gè)單鈴重的QTL位點(diǎn)，其中16個(gè)能在至少3個(gè)環(huán)境中重復(fù)檢測(cè)到。這16個(gè)QTLs中qBW-chr13-7能在7種環(huán)境下檢測(cè)到，包含26個(gè)SNP標(biāo)記，解釋表型變異率在6.13%-14.7%之間。結(jié)合參考基因組共鑒定出344個(gè)候選基因，其中340個(gè)基因含有注釋信息，并利用GO，KEGG和KOG數(shù)據(jù)分別進(jìn)行基因富集分析。為更進(jìn)一步精細(xì)定位和MAS育種奠定基礎(chǔ)。