該研究通過田間試驗(yàn)結(jié)合宏基因組、理化分析及結(jié)構(gòu)方程模型，系統(tǒng)解析了?“稻?–?川芎輪作”?模式降低川芎鎘積累、提升活性成分的分子與微生態(tài)機(jī)制，為道地中藥材安全優(yōu)質(zhì)種植提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐與理論依據(jù)。百邁客生物為該研究提供了宏基因組測序服務(wù)。

研究背景

川芎，作為活血行氣、祛風(fēng)止痛的經(jīng)典中藥材，在中醫(yī)臨床及現(xiàn)代中成藥制劑中應(yīng)用廣泛。然而，隨著土壤環(huán)境污染問題日益顯著，川芎中鎘元素含量超標(biāo)現(xiàn)象屢見不鮮，不僅嚴(yán)重影響藥材質(zhì)量與臨床用藥安全，也制約了川芎產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。在植物降鎘領(lǐng)域，現(xiàn)有研究多集中于施用改良劑、篩選低積累品種或利用植物修復(fù)等。探尋一種既能有效阻控鎘吸收，又能兼顧藥材產(chǎn)量、品質(zhì)與種植效益的農(nóng)藝措施，成為產(chǎn)業(yè)與科研共同關(guān)注的焦點(diǎn)。

對此，國錦琳教授團(tuán)隊(duì)率先將研究視角聚焦于川芎道地產(chǎn)區(qū)廣泛沿用的水稻-川芎輪作（Rice-Chuanxiong?rotation,?RC）模式與傳統(tǒng)種植模式的差異，深入探究這一差異化種植方式背后的生態(tài)效應(yīng)及其應(yīng)用價(jià)值。

研究結(jié)果

該研究采用多學(xué)科整合方法開展系統(tǒng)性探究：首先在四川鎘污染農(nóng)田設(shè)置?“稻?–?川芎輪作（RC）”?與?“川芎連作（CC）”?對照試驗(yàn)，追蹤川芎全生育期生長指標(biāo)；隨后通過HPLC測定活性成分、ICP-MS分析鎘含量、宏基因組解析根際微生物群落；結(jié)合土壤理化性質(zhì)檢測、酶活性分析，最終利用PLS-SEM模型構(gòu)建?“微生物?–?功能?–?土壤性質(zhì)?–?鎘積累”?調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)：

• 輪作顯著提升川芎品質(zhì)與安全性，使川芎根莖鎘含量降低46%（遠(yuǎn)低于藥典?1mg/kg?限值），活性成分藁本內(nèi)酯A含量提升44%，且不影響根莖產(chǎn)量；
• 根際微環(huán)境重塑是關(guān)鍵，輪作顯著富Geobacter、Nitrospira等7個(gè)功能屬，增強(qiáng)碳氮代謝等29條通路；
• 土壤理化性質(zhì)介導(dǎo)降鎘，輪作使土壤pH提升6%-16%、有機(jī)質(zhì)增加?13%-48%，通過吸附與絡(luò)合作用抑制鎘吸收；
• 調(diào)控機(jī)制明確，PLS-SEM模型證實(shí)，輪作通過招募特定微生物→強(qiáng)化碳氮代謝→提升土壤pH與有機(jī)質(zhì)→最終降低鎘積累，該路徑擬合度?0.6957；
• 輪作雖未降低土壤有效態(tài)鎘，但通過改變微生物功能與土壤性質(zhì)阻斷鎘向植株轉(zhuǎn)運(yùn)；
• 根際微生物多樣性在收獲期顯著高于連作，且脫氫酶、蔗糖酶等關(guān)鍵酶活性提升?541%-143%，進(jìn)一步佐證土壤健康改善；
• 輪作還降低了連作中富集的致病與促鎘積累微生物（如Ralstonia、Burkholderia），減少土傳病害風(fēng)險(xiǎn)。

研究總結(jié)

該研究首次揭示了稻芎輪作（RC輪作）模式在降低川芎鎘富集方面的成效與核心機(jī)理。此模式不僅能大幅降低川芎的鎘含量，還能在保障川芎總產(chǎn)量的同時(shí)，顯著推動(dòng)其有效成分的積累，達(dá)成“控鎘、增產(chǎn)、提質(zhì)”的三重目標(biāo)。研究闡明其核心優(yōu)勢機(jī)制：稻芎輪作通過重構(gòu)根際微生物群落，富集碳氮代謝相關(guān)的有益功能微生物，進(jìn)而提升土壤pH值與有機(jī)質(zhì)含量，觸發(fā)了“根際微生物→微生物功能→土壤性質(zhì)→植物鎘積累”的級聯(lián)調(diào)控效應(yīng)，從源頭阻斷了鎘元素向川芎植株的遷移與富集。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，稻芎輪作模式無需額外投入化學(xué)材料、不產(chǎn)生環(huán)境副作用、易于在產(chǎn)區(qū)集成推廣，是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)可行且效益顯著的生態(tài)農(nóng)藝解決方案。該研究成果的發(fā)表，標(biāo)志著在解決中藥材重金屬超標(biāo)問題上取得了重要進(jìn)展，為川芎乃至其他根莖類中藥材的綠色、安全、規(guī)范化生產(chǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的科學(xué)依據(jù)和極具前景的實(shí)踐模式，對保障中藥材質(zhì)量安全、促進(jìn)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展、保護(hù)耕地生態(tài)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

以上內(nèi)容來源于成都中醫(yī)藥大學(xué)，侵刪

近日，北京大學(xué)李毅研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合福建農(nóng)林大學(xué)等多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在Nature上發(fā)表了題為“Perception?of?viral?infections?and?initiation?of?antiviral?defence?in?rice”的研究論文，揭示了水稻感知病毒侵染并啟動(dòng)抗病毒免疫反應(yīng)的分子機(jī)制。百邁客生物為該研究提供了轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)！

研究背景

水稻作為全球半數(shù)以上人口的主糧作物，其產(chǎn)量穩(wěn)定性對糧食安全至關(guān)重要。在過去的20多年里，科學(xué)家在鑒定新病毒、解析病毒致病機(jī)理和植物抗病毒機(jī)制等方面取得了一系列的重要進(jìn)展，但在植物細(xì)胞尤其是禾本科植物細(xì)胞如何感知病毒侵染進(jìn)而啟動(dòng)抗病毒免疫等方面還了解的十分有限。

主要成果

研究發(fā)現(xiàn)水稻RING1-IBR-RING2類型的泛素連接酶RBRL不僅能夠識(shí)別水稻條紋病毒（Rice?stripe?virus，RSV）的外殼蛋白（CP），還能識(shí)別水稻矮縮病毒（Rice?dwarf?virus，RDV）的外殼蛋白P2。進(jìn)一步研究表明，RSV?CP不僅能誘導(dǎo)RBRL表達(dá)量上調(diào)，還能激活RBRL的泛素連接酶活性，進(jìn)而促進(jìn)RBRL介導(dǎo)的茉莉酸信號(hào)通路抑制因子NOVEL?INTERACTOR?OF?JAZ?3（NINJA3）的泛素化和降解，從而激活水稻茉莉酸信號(hào)通路。

水稻抗病毒防御反應(yīng)的分子機(jī)制

這可以理解為，當(dāng)病毒來犯時(shí)，RBRL蛋白迅速“變身”把茉莉酸信號(hào)通路抑制因子NINJA3蛋白“拿下”，從而讓茉莉酸信號(hào)通路“火力全開”，增強(qiáng)水稻的抗病毒能力。

李毅團(tuán)隊(duì)這次的發(fā)現(xiàn)結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期研究成果，在水稻中發(fā)現(xiàn)和解析了一條核心的抗病毒通路，即從水稻細(xì)胞感知和識(shí)別病毒侵染到激活水稻抗病毒免疫機(jī)制全鏈條解析。即以水稻為模式，發(fā)現(xiàn)了從RBRL介導(dǎo)對病毒外殼蛋白感知和識(shí)別（Nature,?2025）、茉莉酸信號(hào)通路（JA）抑制子降解（Nature,?2025）、到茉莉酸信號(hào)通路激活RNA沉默核心蛋白（AGO18）表達(dá)（Cell?Host?&?Microbe,?2020）以及AGO18介導(dǎo)的RNAi和ROS協(xié)同防御的完整抗病毒免疫通路（Molecualr?Plant,?2019;?Nature?Plants,?2017;?eLife,?2015;?PLoS?Pathogens,?2011）。

研究總結(jié)

該研究為水稻抗病毒育種提供了多靶點(diǎn)策略：
1）利用RBRL廣譜識(shí)別特性開發(fā)廣譜抗病毒種質(zhì)；
2）通過精細(xì)調(diào)控JA信號(hào)通路增強(qiáng)基礎(chǔ)抗性；
3）協(xié)同優(yōu)化RNAi與ROS防御系統(tǒng)。

這一系統(tǒng)性成果將為作物抗病毒研究和育種提供新的理論框架和技術(shù)路徑。李毅團(tuán)隊(duì)介紹，通過優(yōu)化RBRL蛋白功能、增強(qiáng)茉莉酸信號(hào)通路活性，以及強(qiáng)化RNA干擾（RNAi）與活性氧（ROS）協(xié)同防御能力等多種技術(shù)路徑，未來有望培育出更具抗病能力的水稻新品種，從而降低病毒病害帶來的農(nóng)業(yè)損失，提高糧食生產(chǎn)穩(wěn)定性。同時(shí)，這一研究為全球水稻生產(chǎn)提供了新的抗病毒策略，助力可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展。

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中文題目：利用Pacbio Iso-Seq測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)水稻非生物脅迫下的新轉(zhuǎn)錄本和新基因

發(fā)表期刊：International Journal of Molecular Sciences

發(fā)表時(shí)間：2020年10月31日

影響因子：4.556

研究背景

全球氣候變化導(dǎo)致高溫、干旱和夜間高溫等非生物脅迫條件的嚴(yán)重程度和頻率增加，這些都造成了作物產(chǎn)量的降低。隨著世界人口的增長，植物育種專家面臨著開發(fā)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、減少環(huán)境污染的新品種的艱巨任務(wù)。水稻是世界上一半以上人口的主要卡路里來源，特別是對亞洲最貧窮的人來說。世界各地的基因庫中保存著23萬多份水稻及其野生近緣種的廣泛自然遺傳多樣性的種質(zhì)資源，是一種無價(jià)的可用于作物改良的重要基因庫。

雖然世界上近80%的水稻種植是基于indica（秈稻亞種）品種，但目前的標(biāo)準(zhǔn)基因組及其注釋來自粳稻亞種Nipponbare。由于缺乏適當(dāng)?shù)幕蚪M，不同水稻亞種的研究大多都基于Nipponbare基因組。例如，在3000水稻基因組計(jì)劃中將測序序列比對到Nipponbare基因組上，丟棄了不能比對到該參考基因組的序列。這可能會(huì)導(dǎo)致非粳稻亞種特有的遺傳信息的丟失。另外，最近已經(jīng)對其它水稻亞種的栽培品種的基因組進(jìn)行了測序，例如indica（Shuhui498，Zhenshan 97, Minghui 63）、aus（Kasalath，N22），但其完整性和注釋程度仍存在差異。值得注意的是aus亞種是抗病、耐磷酸鹽缺失、耐澇、耐厭氧發(fā)育和抗旱等潛在性狀的寶貴基因來源。例如，在aus品種基因組中發(fā)現(xiàn)了耐磷酸鹽缺失相關(guān)基因OsPSTOL1、耐澇相關(guān)基因OsSNORKEL1/2和OsSUB1A。值得注意的是，這些基因在粳稻的Nipponbare亞種基因組序列中是不存在的。

在過去的幾年里，RNA測序（特別是基于illumina的短序列RNA-seq）已經(jīng)成為分析轉(zhuǎn)錄組的有力工具，用來識(shí)別在非脅迫控制和各種環(huán)境脅迫條件下差異表達(dá)的基因。然而，需要基于參考基因組或轉(zhuǎn)錄組序列對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比對和注釋來確定轉(zhuǎn)錄水平。在水稻中，參考基因組決定了可以鑒別的差異表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄本亞型。顯然，參考基因組/轉(zhuǎn)錄組中沒有的基因的表達(dá)信息在分析過程中會(huì)丟失。這在研究耐脅迫的外來品種、陸地品種或野生稻種時(shí)尤其相關(guān)，因?yàn)樗鼈兛赡芎袇⒖计贩NNipponbare不存在的耐受基因。這將嚴(yán)重限制識(shí)別支持作物改良計(jì)劃的新候選基因的可能性。
解決這一問題的一個(gè)顯而易見的辦法是對所需的基因組進(jìn)行測序、組裝和注釋。但是，這種方法比較昂貴和耗時(shí)。在這篇文章里，我們探索了一種更有針對性的RNA-Seq序列方法來測序和重建了三個(gè)不同亞種的水稻品種的部分轉(zhuǎn)錄本作為參考，Pacific Bioscience（PacBio）屬于提供高通量全長轉(zhuǎn)錄本序列的新一代測序方法。該方法已成功應(yīng)用于對現(xiàn)有植物轉(zhuǎn)錄本及注釋的探索和擴(kuò)展，如高粱、小麥、甘蔗、野生棉花、不同的穗型草、苜蓿等。

取樣材料

樣品取自三個(gè)水稻品種的10個(gè)不同亞種的不同組織部位（表1）：

分析結(jié)果

1.重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本

使用PacBio Sequel I測序平臺(tái)對每個(gè)品種進(jìn)行SMRT測序，得到15.49~24.51GB的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)。用IsoSeq3軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行ccs和lima處理，每個(gè)品種SMRT cell分別得到460340~736747條全長非嵌合序列（full-length non-chimeric reads簡稱FLNC，包含3 ‘ 引物、5 ‘ 引物以及polyA尾）。全長非嵌合經(jīng)過IsoSeq3聚類和polish分別得到37951~54684高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本（HQ）以及1233 ~2170低質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本（LQ）。先將HQ與NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastn比對（E<=1e-10），再將上一步為比對上的轉(zhuǎn)錄本序列與NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastx比對（E<=1e-10），去除未比對上兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄本序列，最終得到37535~54594條HQ用于后續(xù)分析（表2）。

Pacbio RSII平臺(tái)聲明使用RNA-seq二代測序數(shù)據(jù)對轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正，可以得到更多的HQ序列，因?yàn)長Q序列中含有大量的插入和缺失。然而與RSII相比，PacBio Sequel I測序平臺(tái)的測序結(jié)果更好。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，我們用minimap2將未矯正的HQ比對到相應(yīng)亞種的基因組，結(jié)果表明缺失的比例很小，所以進(jìn)一步的分析中沒有包含LQ序列。

2.轉(zhuǎn)錄本去冗余

在文庫準(zhǔn)備過程中，會(huì)產(chǎn)生5 ‘ RNA降解產(chǎn)物，并進(jìn)行測序。這些降解產(chǎn)物具有相同的外顯子結(jié)構(gòu)，但缺乏5 ‘序列信息，因此產(chǎn)生與技術(shù)偏差或生物學(xué)背景無關(guān)的冗余異構(gòu)體。我們測試了三種不同的去冗余方法，包括cogent、cDNA cupcake和TAMA，其中cDNA cupcake和TAMA需要基于參考基因組，而cogent不需要基于參考基因組。cogent基于pacbio全長轉(zhuǎn)錄本序列重構(gòu)一個(gè)參考基因組，然后將相同的序列比對到重建的基因組，基于比對結(jié)果利用cDNA cupcake算法對轉(zhuǎn)錄本去冗余。cDNA cupcake和TAMA直接用minimap2軟件和各自的亞種參考基因組進(jìn)行比對?；谶@三種方法，只有很少的轉(zhuǎn)錄本不能回比到基因組上（表3）。總的來說，這三種去冗余方法均能顯著減少異構(gòu)體的數(shù)量，分別為47.6% （cDNA cupcake，Nipponbare）和68.3%（cogent，Dular）。

基于植物中430個(gè)高度保守的同源蛋白利用BUSCO軟件對TAMA算法去冗余前后的HQ進(jìn)行完整性評估（圖一），由于取樣不完全，缺失了54%~27%的重要蛋白，其中Nipponbare參考基因組（IRGSP）只缺失了6種。cDNA cupcake和TAMA的結(jié)果相似，而對于cogent，超過50%的蛋白缺失，最有可能的原因是轉(zhuǎn)錄本沒有回比到重建的基因組。

去冗余后轉(zhuǎn)錄本長度中值都有所增長，長度分布和轉(zhuǎn)錄本長度中值與Nipponbare參考基因組相似。統(tǒng)計(jì)了去冗余后10個(gè)品種每個(gè)基因相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，其中基因只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的比例，TAMA最高達(dá)到了75%，cDNA cupcake在60%左右，cogent只有50%。同時(shí)計(jì)算了Nipponbare參考基因組每個(gè)基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量進(jìn)行比較，該參考基因中基因只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的比例達(dá)到了85%（圖2）。

來自同一亞種的不同品種親緣關(guān)系更近，我們使用系統(tǒng)發(fā)育樹評估亞種之間的遺傳距離。利用去冗余后的轉(zhuǎn)錄本序列基于Nipponbare參考基因組識(shí)別SNPs，使用SNPhylo繪制進(jìn)化樹（圖3）。SNPhylo提取高質(zhì)量并且具有代表性的SNPs進(jìn)行后續(xù)分析，cDNA cupcake算法大約30000個(gè)SNPs，cogent算法大約23200個(gè)SNPs，TAMA算法大約16000個(gè)SNPs。三種方法中，同一亞種的不同品種聚類在了一起，cDNA cupcake算法和cogent的聚類結(jié)果更相似。三種方法均能將aus與另外兩個(gè)亞種區(qū)分開，但cogent和TAMA對indica和japonica種間的區(qū)分不如cDNA cupcake明顯。

3.評估重構(gòu)的轉(zhuǎn)錄本

基于TAMA算法得到的HQ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的評估。由于TAMA只對比對到參考基因組上的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行去冗余，我們用cogent對沒比對上參考基因組的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行去冗余。合并結(jié)果后，每個(gè)品種最終得到10511（Dular）~15011（IR64）個(gè)基因，14255（Dular）~20803（Moroberekan）個(gè)轉(zhuǎn)錄本（表4）。與Nipponbare參考基因組相比，大約三分之一的基因位點(diǎn)和大約一半的轉(zhuǎn)錄模型被重建。每個(gè)品種每個(gè)基因的平均轉(zhuǎn)錄數(shù)約為1.4～1.5，略高于參考基因組的1.2。中位轉(zhuǎn)錄本長度為986 bp（Dular）~1394 bp（Nipponbare），與Nipponbare參考值1385 bp相似。平均GC含量在50.87%（Dular）~52.76%（IR64），與Nipponbare參考值51.24%相似。利用gffcompare軟件與Nipponbare參考基因組進(jìn)行比較識(shí)別新基因與轉(zhuǎn)錄本。

4.功能注釋

為了深入了解重建轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)信息，我們進(jìn)行了功能注釋。使用TransDecoder軟件預(yù)測開放閱讀框（ORFs），包括blast和PFAM，結(jié)果表明大約有60%~70%的完整ORFs（包括啟動(dòng)和終止密碼子）。此外還發(fā)現(xiàn)了26%~38%的5 ‘ ORF、很少比例的3 ‘ ORF和中間ORF（既沒有起始密碼子也沒有終止密碼子）（圖4）。

使用Trinotate和Mercator4進(jìn)行功能注釋。Mercator4是專門為植物開發(fā)的，它使用了一種簡單的層次樹結(jié)構(gòu)，被稱為“容器”，用來描述生物學(xué)概念。主要的生物過程如光合作用，都是由頂層的容器來表示的，每個(gè)子容器描述的是一個(gè)更詳細(xì)的子過程。目前本體包括27個(gè)功能類別，代表了植物中不同的生物過程。N22、IR64和Nipponbare三個(gè)品種作為各自亞種的代表與植物中所有水稻基因的分類進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示三個(gè)品種的注釋結(jié)果分布相似（圖5）。超過28000個(gè)水稻已知基因在Mercator庫中沒有注釋分類信息，因此三個(gè)品種有8000~10000個(gè)轉(zhuǎn)錄本沒有分類注釋到Mercator庫。

5.品種間共有和特有的轉(zhuǎn)錄本

為了鑒定品種特異性轉(zhuǎn)錄本，以N22、IR64和Nipponbare三個(gè)品種的轉(zhuǎn)錄本作為blast比對庫，其它9個(gè)品種與其進(jìn)行比對（圖6）。識(shí)別到N22特有轉(zhuǎn)錄本652個(gè)，IR64特有轉(zhuǎn)錄本2426個(gè)，Nipponbare特有轉(zhuǎn)錄本349個(gè)。

6.aus特有轉(zhuǎn)錄本的差異表達(dá)分析

aus品種N22特別抗旱和耐熱脅迫，因此我們想知道在這些條件下是否有aus特異轉(zhuǎn)錄本受到調(diào)控。以N22為研究對象，分析干旱和熱脅迫下差異表達(dá)的基因。利用從發(fā)育種子中分離的RNA進(jìn)行Illumina測序，將測序數(shù)據(jù)回比到重構(gòu)的N22轉(zhuǎn)錄本。使用DESeq2基于參數(shù)FDR<0.1和|log2FC|>=1軟件識(shí)別出56個(gè)aus特異的差異表達(dá)基因。這56個(gè)差異基因進(jìn)行blast比對，其中46%比對上擬南芥，27%沒有任何注釋信息，11%僅描述了一個(gè)PFAM域或與其它植物物種的序列同源，而在水稻中僅有5%已知同源基因。

舉個(gè)例子，在高溫和干旱雙重脅迫下顯著上調(diào)的基因B12288。它在japonica和indica中均有同源基因RAB21，這個(gè)基因受干旱的誘導(dǎo)，其編碼的蛋白屬于LEA脫氫蛋白家族。與水稻其它脫氫蛋白進(jìn)行多序列比對研究（圖7），N22實(shí)際上的基因與野生稻、O. sativa ssp. japonica中其它4種脫氫酶的親緣關(guān)系密切。序列覆蓋率為89.5%，序列同源性86.0%，其中包含脫氫酶高度保守的重復(fù)區(qū)。相比japonica蛋白，N22蛋白序列與野生稻更接近。

總結(jié)
本文主要探討了Pacbio Iso-Seq獲得的轉(zhuǎn)錄本相比于Nipponbare參考基因組是否可以用于aus等水稻亞種的下游分析。此外通過這些轉(zhuǎn)錄本，我們希望發(fā)現(xiàn)水稻非生物脅迫下新的轉(zhuǎn)錄本和基因。我們的分析表明所有品種都可以鑒定出特異的轉(zhuǎn)錄本，還確定了aus亞種特異的差異表達(dá)基因。Pacbio Iso-Seq這種方法適用于其它沒有基因組或者基因組質(zhì)量不高的物種，相比對基因組組裝，這種方法更省時(shí)便宜。

研究背景

水稻是最重要的糧食作物之一，在過去的50年里，通過雜交育種已經(jīng)大幅度提高了水稻的產(chǎn)量。然而雜交育種最近幾年也遇到了瓶頸，多倍體化則成為水稻育種的另一條思路。多倍體化能夠提高優(yōu)勢基因發(fā)生重組和相互作用的可能性，提高水稻對環(huán)境的適應(yīng)能力。

同源四倍體水稻（autotetraploid rice）是二倍體水稻經(jīng)過染色體加倍形成的新種質(zhì)。同源四倍體水稻亞種間雜種F1具有強(qiáng)大的生物學(xué)優(yōu)勢，蘊(yùn)含著巨大的增產(chǎn)潛力，可望成為未來水稻育種的新途徑。然而，其雜種F1普遍存在育性偏低，產(chǎn)量優(yōu)勢難以發(fā)揮，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上難以直接應(yīng)用的問題。所以，如何創(chuàng)制育性正常且能克服雜種F1不育性的新型四倍體（neo-tetraploid）是利用其優(yōu)勢的關(guān)鍵。

為了避免同源四倍體水稻育性偏低的問題，華南農(nóng)大某研究組經(jīng)過20年的努力，培育出2個(gè)新型四倍體水稻，其結(jié)實(shí)率可達(dá)80%以上，于2016年獲得國家植物新品種權(quán)。本研究旨在通過轉(zhuǎn)錄組測序，研究新型四倍體（Huaduo 3）與同源四倍體雜交F1代的花藥、子房和葉片的基因表達(dá)情況，為解析新型四倍體育性和雜種優(yōu)勢的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。

材料方法

新型四倍體水稻Huaduo 3（H3），40種不同的同源四倍體水稻，以及雜交F1代。同源四倍體水稻 Huajingxian 74-4x（T452）與H3的雜交F1代用于測序分析。
轉(zhuǎn)錄組測序：取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開花階段的旗葉。每個(gè)組織每種品系有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共27個(gè)樣品。測序平臺(tái)為Illumina HiSeq 2500，平均每個(gè)樣品測約5G。
小RNA測序：取T452，H3及雜交F1代的減數(shù)分裂階段的花藥進(jìn)行小RNA測序，無生物學(xué)重復(fù)。
全基因組重測序：兩個(gè)親本T452和H3的葉片DNA用于全基因組重測序。
嗯，測序手段還是挺多滴！

技術(shù)路線

研究結(jié)果

1.新型四倍體水稻Huaduo 3（H3）的育種及其與其它四倍體水稻的雜交過程
將兩種同源四倍體水稻（Jackson-4x和96025）進(jìn)行雜交，獲得F1代雜交種。F1代雜交種再進(jìn)行連續(xù)自交，到F5代時(shí)發(fā)現(xiàn)一株水稻有80%的結(jié)實(shí)率，這株水稻經(jīng)過多代連續(xù)自交，到F10-F13代時(shí)出現(xiàn)可以穩(wěn)定遺傳的高結(jié)實(shí)率性狀，這個(gè)品系被命名為Huaduo 3（H3）。H3不僅結(jié)實(shí)率高，還有其它高產(chǎn)性狀（表1），其花粉母細(xì)胞有90%以上是正常的。
將H3與40種其它品系的同源四倍體水稻（26個(gè)印度種和14個(gè)日本種）進(jìn)行雜交，獲得的40種F1代表現(xiàn)出了很多大大優(yōu)于親本的性狀，尤其是單株谷粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、單株產(chǎn)量等性狀。為了進(jìn)一步研究雜交F1代的雜種優(yōu)勢，我們挑選了T452和H3的雜交F1代進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究。T452是一種育性較低的同源四倍體，雜交F1代的高親優(yōu)勢幾乎都是正的，除了谷粒長度和10谷粒寬度兩個(gè)指標(biāo)。雜交F1代的中親優(yōu)勢除了10谷粒寬度這一個(gè)指標(biāo)以外都是正的，說明雜交F1代表現(xiàn)出了明顯的雜種優(yōu)勢。
高親優(yōu)勢（High-parent heterosis，HPH）是指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與高值親本（HP）同一性狀數(shù)值差值的比率。高親優(yōu)勢（%）=(F1-HP)/HP*100%。
中親優(yōu)勢（Mid-parent heterosis，MPH）指雜交F1代的產(chǎn)量或者某一數(shù)量性狀的數(shù)值與雙親（P1和P2）同一性狀的平均值差值的比率。中親優(yōu)勢（%）=[F1-(P1+P2)/2]/(P1+P2)/2*100%。

表一：T452與H3雜交F1代的雜種優(yōu)勢。HPH：高親優(yōu)勢；MPH中親優(yōu)勢；PH：植株高度；EP：單株谷粒數(shù)；FG：單花谷粒數(shù)；SS：結(jié)實(shí)率；GYP：單株產(chǎn)量；GL：10谷粒長度；GW：10谷粒寬度。

圖1：親本和雜交F1代的表型。（A）Jackson-4x（T45），Huaduo 3（H3）與96025（T44）的谷粒大小，H3是來自T45和T44的雜交；（B）H3在大田中的長勢；（C）T45，H3，T44的植物表型；（D）Shennong15-4x（T424），H3，以及兩者雜交F1代的表型。

2.轉(zhuǎn)錄組測序
因?yàn)門452和H3的雜交F1代表現(xiàn)出了優(yōu)良性狀，因此可以通過轉(zhuǎn)錄組測序研究性狀差異的原因。取T452，H3及雜交F1代的三種不同組織分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，包括減數(shù)分裂階段的花藥、減數(shù)分裂階段的子房、開花階段的旗葉?？偣矞y了548M clean reads，平均有89.06%的reads可以比對到參考基因組上，其中93.45%都是比對到唯一位置上。三個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間的相關(guān)性都達(dá)到了0.8以上。用qRT-PCR的方法對12個(gè)差異表達(dá)基因（DEG）的表達(dá)量進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果一致。對不同樣品進(jìn)行層次聚類分析表明，相同組織的樣品總能聚到一塊（圖2）。

圖2：所有基因的層次聚類分析。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

3.差異表達(dá)基因（DEG）分析及注釋
在三個(gè)不同株系中共發(fā)現(xiàn)17877個(gè)DEG，兩兩比較的DEG數(shù)目在1521到2498之間（表2）。F1和親本之間的DEG稱為DEGF，親本之間的DEG稱為DEGP。DEGF的基因能分為兩個(gè)不同的組，其中一個(gè)組在DEGP里面也有，另一個(gè)組只屬于DEGF，后者被稱為DEGFu。這些DEGFu基因能夠解釋F1和親本之間的表型差異，因此接下來的研究種重點(diǎn)關(guān)注DEGFu基因。在這17877個(gè)DEG里面，有1150，1014，1122個(gè)DEGFu與花藥、子房、葉片有關(guān)，其中分別有807，663，866個(gè)基因與花藥、子房、葉片特異相關(guān)，這些基因被稱為DEGFu-sp。

表2：三個(gè)不同組織中的差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)。AN：花藥；OV：子房；LE：葉片。

為了研究DEGFu-sp基因的功能，我們首先研究了其中的轉(zhuǎn)錄因子，共發(fā)現(xiàn)了44個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，花藥里面16個(gè)，子房里面10個(gè)，葉片里面18個(gè)。對DEGFu-sp基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析表明這些基因相互之間有顯著的聯(lián)系，多個(gè)代謝通路富集程度較高。

GO富集分析表明花藥中的DEGFu-sp基因有19個(gè)生物學(xué)過程類別顯著富集，包括光合作用、代謝途徑、合成調(diào)控和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。6個(gè)通路類別顯著富集，包括光合作用和代謝通路。13個(gè)基因在F1中的表達(dá)量顯著高于T452。在807個(gè)花藥特異的DEGFu-sp中，15個(gè)基因與46個(gè)其它重要基因共表達(dá)。

接下來用同樣的方法對子房和葉片中的DEGFu-sp基因進(jìn)行了GO富集分析。在葉片當(dāng)中有5個(gè)基因在F1中表達(dá)量顯著高于T452。H3水稻葉片在開花過程中顏色逐漸變化，而T452葉片在開花過程中顏色保持不變。因此，我們比較了葉片中F1比T452上調(diào)的基因，以及H3比T452上調(diào)的基因，兩者有74.01%的重合。有趣的是，在葉片中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)主要的功能基因類別，分別是程序性細(xì)胞死亡和防御反應(yīng)。

4. 花藥特異性差異表達(dá)基因與減數(shù)分裂有關(guān)

因?yàn)門452育性較低，而F1代育性較高，為了研究育性的差異，我們重點(diǎn)研究了F1花藥中與T452相比上調(diào)的基因。首先，有643個(gè)基因在F1花藥中與T452相比特異上調(diào)，這其中排除了H3與T452相比上調(diào)的基因。對這643個(gè)基因進(jìn)行GO分析表明，有6個(gè)功能基因類別富集，這些基因與防御反應(yīng)、光合作用、細(xì)胞凋亡和程序性細(xì)胞死亡有關(guān)。這其中有41個(gè)基因在育性較低的同源四倍體中表達(dá)量低于二倍體。在這41個(gè)基因中，4個(gè)基因，LOC_Os04g33830，LOC_Os12g08770，LOC_Os06g21590，LOC_Os07g25430，與光合作用有關(guān)。

接下來，將這643個(gè)特異上調(diào)的基因與野生型水稻花藥減數(shù)分裂相關(guān)基因的表達(dá)量相互比較，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)基因都在減數(shù)分裂前期到四分體期表達(dá)。

隨后，我們比較了花藥特異性差異表達(dá)基因DEGFu-sp和野生型水稻減數(shù)分裂相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)有42個(gè)減數(shù)分裂特異性基因和8個(gè)減數(shù)分裂相關(guān)基因（圖3）。在8個(gè)減數(shù)分裂相關(guān)的基因中，有兩個(gè)基因和DNA修復(fù)和染色體結(jié)構(gòu)有關(guān)。

因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組也會(huì)被表觀遺傳調(diào)控，我們也進(jìn)了小RNA測序。在花藥中發(fā)現(xiàn)了288個(gè)差異表達(dá)的miRNA（DER），其中有13個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的。在這288個(gè)DER中，有38個(gè)只在F1與親本相比中特有，這38個(gè)基因被稱為DERFu。這38個(gè)DERFu有397個(gè)靶標(biāo)基因。GO分析表明這397個(gè)靶標(biāo)基因有7個(gè)功能基因類別富集，這些基因與細(xì)胞凋亡、防御反應(yīng)、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞自噬、DNA完整性和脅迫反應(yīng)有關(guān)。而且，大部分靶標(biāo)基因同于F1或者H3中上調(diào)的基因。然后我們比較了這38個(gè)DERFu與之前發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)miRNA數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)miRNA，osa-miR5072_L-2_1ss3AG，在

Taichung65-2x和 Taichung65-4x水稻中的四倍體中下調(diào)。這個(gè)miRNA靶標(biāo)基因?yàn)?LOC_Os02g24960，是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因。

圖3：與育性和雜種優(yōu)勢相關(guān)的基因在染色體上分布。紅色為葉片中的基因，藍(lán)色為花藥中的基因，黑色為子房中的基因。

表3：花藥中的差異表達(dá)miRNA（DER）列表

5.雜交F1代非累加基因表達(dá)
F1代表達(dá)的基因可以分成兩個(gè)類別，一類是累加基因，一類是非累加基因。累加基因的表達(dá)量來自兩個(gè)親本的等位基因之和，非累加基因的表達(dá)量由兩個(gè)親本等位基因的平均值決定。在三個(gè)組織中共發(fā)現(xiàn)了1224個(gè)非累加基因（NDEG），在花藥、子房和葉片中分別為314個(gè)，578個(gè)，332個(gè)。其中895個(gè)上調(diào)，329個(gè)下調(diào)。通過對花藥NDEG和水稻花藥減數(shù)分裂特異性基因表達(dá)數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn)了53個(gè)共有的基因。其中有7個(gè)基因在四倍體中表達(dá)量低于二倍體水稻。

表4：非累加表達(dá)基因（NDEG）和DEGFu及不同組織的DEGFu-sp數(shù)量統(tǒng)計(jì)。星號(hào)表示NDEG在F1表達(dá)的總基因中的比例。

6.DNA序列差異與雜交F1代的差異表達(dá)基因之間的關(guān)系
DNA重測序表明T452和H3有很多序列差異，兩者共有2351039個(gè)SNP，其中1192412個(gè)SNP在T452中特異存在，374460個(gè)SNP在H3中特異存在。兩者共有499448個(gè)Indel，其中248194個(gè)Indel在T452中特異存在，84196個(gè)Indel在H3中特異存在。將T452和H3相比，SNP和Indel多態(tài)性分別為66.77%和69.97%。在這些多態(tài)性位點(diǎn)中，約65%的SNP和72%的Indel在基因區(qū)。47.67%的SNP和53.37%的Indel位于差異表達(dá)基因的調(diào)控區(qū)域。另外，有58908個(gè)SNP和5561個(gè)Indel位于基因編碼區(qū)。
因?yàn)門452和H3存在大量的DNA序列差異，我們分析了DEGFu-sp中基因的DNA序列差異，結(jié)果表明花藥、子房和葉片中分別有330個(gè)、291個(gè)、459個(gè)基因存在DNA序列差異（SNP或Indel）?；ㄋ幭嚓P(guān)的330個(gè)基因可以分為15個(gè)不同的生物學(xué)過程類別，主要和光合作用、細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)錄和生物合成有關(guān)。子房相關(guān)的基因有1個(gè)生物學(xué)過程富集，即代謝通路。同樣的，葉片相關(guān)的基因有8個(gè)生物學(xué)過程富集，包括氮代謝、細(xì)胞運(yùn)輸?shù)?。這些富集的生物學(xué)過程基本上與DEGFu-sp富集的生物學(xué)過程一致。
另外，非累加差異表達(dá)基因中也有SNP和Indel，花藥、子房和葉片中分別有67個(gè)、133個(gè)、87個(gè)基因存在DNA序列差異，并對這些基因進(jìn)行了富集分析。其中25個(gè)基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子。

結(jié)論

本研究培育了一個(gè)新型四倍體水稻H3，H3與同源四倍體T452雜交產(chǎn)生的F1代具有育性高、產(chǎn)量高等優(yōu)良的雜種優(yōu)勢性狀。通過比較H3，T452，以及雜交F1代的三個(gè)不同組織（花藥、子房、葉片）的轉(zhuǎn)錄組差異，尤其是重點(diǎn)分析了花藥的轉(zhuǎn)錄組差異，找到了多個(gè)與減數(shù)分裂有關(guān)的差異表達(dá)基因，這些基因可能與雜種優(yōu)勢有關(guān)。對花藥的小RNA測序也找到了一些F1中差異表達(dá)的miRNA，這些miRNA的靶基因也與轉(zhuǎn)錄組測序中上調(diào)的基因有大部分重合，說明miRNA可能參與調(diào)控了雜交F1代的性狀差異。對兩個(gè)親本DNA序列的差異進(jìn)行全基因組重測序分析，并與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，找到了DNA層面上兩者育性差異的可能原因。

創(chuàng)新點(diǎn)

培育出高結(jié)實(shí)率的新型四倍體水稻，可以用于四倍體水稻育種；
轉(zhuǎn)錄組測序比較了新型四倍體水稻，同源四倍體水稻及雜交F1代不同組織的轉(zhuǎn)錄組差異，找到了影響四倍體水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因；
小RNA測序和全基因組重測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，深入解析性狀差異原因。

點(diǎn)評

這篇文章選取的實(shí)驗(yàn)材料很好，性狀優(yōu)良，而且研究得很深入，比較了三種水稻三個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄組，還進(jìn)行了小RNA測序和全基因組重測序。通過深入分析，找到了一些影響水稻育性和雜種優(yōu)勢的相關(guān)基因，為后續(xù)的育種工作打下了基礎(chǔ)。
對多種測序手段結(jié)合分析感興趣的小伙伴快來試試吧！

參考文獻(xiàn)

Guo H, Mendrikahy J N, Lei X, et al. Transcriptome analysis of neo-tetraploid rice reveals specific differential gene expressions associated with fertility and heterosis[J]. Scientific reports, 2017, 7:40139.