該研究證明了部分腸道菌群與IgAN的之間的機(jī)制關(guān)系，為開(kāi)發(fā)針對(duì)微生物群的食物干預(yù)措施改善IgAN提供科學(xué)依據(jù)。百邁客生物為該研究提供了全長(zhǎng)16S?rRNA測(cè)序服務(wù)。

研究背景

IgA腎?。↖gAN）是全球最常見(jiàn)的免疫介導(dǎo)的原發(fā)性腎小球疾病，每年每10萬(wàn)成年人中至少有2.5例發(fā)病。具有顯著的終身進(jìn)展至終末期腎?。‥SRD）的風(fēng)險(xiǎn)，約20%-40%的IgAN患者會(huì)在10至20年內(nèi)進(jìn)展至終末期腎病。因此迫切需要發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)和新的干預(yù)策略。

一般來(lái)說(shuō)，人類腸道中居住著數(shù)以萬(wàn)億的細(xì)菌，這些細(xì)菌以膳食營(yíng)養(yǎng)為燃料，可合成多種生物活性化合物。這些微生物代謝物進(jìn)一步向體內(nèi)遠(yuǎn)處的器官發(fā)出信號(hào)，使它們能夠與激素和免疫系統(tǒng)以及宿主的新陳代謝及其他功能相連接，腸道與宿主免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的相互作用影響著身體功能，這些功能將其與其他器官聯(lián)系起來(lái)，并導(dǎo)致它們之間形成“軸”。

慢性腎臟病通常是進(jìn)行性且不可逆的，腸道微生物群作為環(huán)境與人類之間的橋梁，在慢性腎臟疾病的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著根本性作用。IgA?腎病（IgAN）與腸道微生物群的平衡息息相關(guān)。然而，目前還不清楚腸道微生物群的變化是否會(huì)減弱IgAN或影響其進(jìn)展。

研究結(jié)果

? IgAN引起腎損傷和腎功能下降

根據(jù)以上研究背景，作者首先確認(rèn)了IgAN小鼠模型的成功建立。通過(guò)分析小鼠腎臟IgA免疫熒光染色，與對(duì)照組相比，IgAN組腎小球IgA（p?<?0.001）、C3（p?<?0.01）和IgG（p?<?0.001）沉積顯著增加。PAS染色顯示，IgAN組腎小球系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增多及基底膜增厚。腎功能指標(biāo)評(píng)估顯示，與對(duì)照組相比，IgAN組小鼠血尿素氮（BUN）（p?<?0.001）、尿酸（UA）（p?<?0.01）、血清肌酐（Scr）（p?<??0.01）、血白蛋白（BAL）（p?<?0.05）及尿蛋白/肌酐比值（ACR）（p?<??0.001）水平顯著增加，IgAN組腎功能顯著下降，這可能與腎臟結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。

? IgAN引起腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂和多樣性失衡

通過(guò)構(gòu)建IgAN動(dòng)物模型，作者發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，IgAN組的α多樣性分析均顯著降低。此外，采用非加權(quán)組平均法聚類（UPGMA樹(shù)）分析、非度量多維尺度分析（NMDS）和主坐標(biāo)分析（PCoA）進(jìn)行相似性聚類分析。結(jié)果顯示，IgAN組與對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的微生物聚類，兩組間存在清晰的分組，表明IgAN誘導(dǎo)了微生物群落的轉(zhuǎn)變。

為識(shí)別IgAN腸道微生物群的有效特征，作者進(jìn)行了LEfSe（線性判別分析效應(yīng)大小)。發(fā)現(xiàn)在屬水平上，IgAN組中另枝菌屬（Alistipes）、鏈球菌屬（Streptococcus）、文肯菌屬（Rikenella）、埃希氏菌屬（Escherichia?Shigella）和乳酸桿菌（Lactobacillus）的豐度顯著增加。

相對(duì)應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，以上結(jié)果表明，IgAN誘導(dǎo)了腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂和多樣性失衡。

? IgAN引起腸道屏障損傷和腸道B細(xì)胞免疫失衡

隨后作者采用蘇木精-伊紅（H&E）染色法評(píng)估了各組治療小鼠的結(jié)腸完整性，以確定IgAN引起的腸道通透性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組小鼠的黏膜上皮完整，固有層內(nèi)腺體豐富且排列致密有序，肌層結(jié)構(gòu)清晰。與此同時(shí)，IgAN模型小鼠的腸道腺體結(jié)構(gòu)疏松，局部出現(xiàn)松散，肌層增厚，并伴有輕微的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，通過(guò)對(duì)腸道通透性指標(biāo)的評(píng)估發(fā)現(xiàn)，IgAN組小鼠血清中的二胺氧化酶（DAO）（p?<?0.001）、D-乳酸（D-LA）（p?<??0.01）和脂多糖（LPS）（p?<?0.01）水平顯著升高，尤其是在DAO水平上，這表明IgAN模型小鼠的腸道通透性增加。

通過(guò)評(píng)估B細(xì)胞活化因子和IgA水平，企圖闡明了IgAN的免疫失衡機(jī)制。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，IgAN組小鼠的B細(xì)胞活化因子（BAFF）（p?<??0.001）和增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）（p??<??0.001）水平顯著升高。IgA水平也異常升高（p?<?0.01），這表明B細(xì)胞過(guò)度活化導(dǎo)致IgA穩(wěn)態(tài)失衡。

總結(jié)來(lái)說(shuō)，IgAN模型小鼠的腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致其腸道屏障完整性降低和B細(xì)胞IgA分泌失衡。

? COS可重塑IgAN小鼠模型的菌群失調(diào)

隨后，作者為探索調(diào)節(jié)IgAN的特定微生物群是否能改善疾病進(jìn)展，應(yīng)用了COS對(duì)IgAN中失調(diào)的微生物群進(jìn)行靶向調(diào)節(jié)。α多樣性比較結(jié)果顯示，經(jīng)不同劑量COS干預(yù)后，IgAN小鼠模型的腸道微生物群整體得到恢復(fù)。β多樣性分析（PCoA和PLS-DA）表明，與對(duì)照組相比，COS干預(yù)后的腸道微生物群表現(xiàn)出顯著改變，其結(jié)構(gòu)向?qū)φ战M方向轉(zhuǎn)變。

腸道微生物群組成分析顯示，不同劑量COS干預(yù)后富集的微生物群存在差異：COS-L組主要富集未分類的毛螺菌科（unclassified?Lachnospiraceae）、支原體屬（Anaeroplasma）、振蕩桿菌屬（Oscillibacter）、嗜木糖真桿菌群（Eubacterium?xylanophilum?group）和單球?qū)伲∕onoglobus）；而COS-H組主要富集未培養(yǎng)的擬桿菌目細(xì)菌（uncultured?Bacteroidales?bacterium）、理研菌屬（Rikenella）、臭味桿菌屬（Odoribacter）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。

與此同時(shí)發(fā)現(xiàn)：COS-L（低劑量殼寡糖）和COS-H（高劑量殼寡糖）均有效抑制了IgAN模型中顯著增加的微生物豐度，由此，實(shí)現(xiàn)了對(duì)IgAN模型腸道微生物群的反向平衡調(diào)節(jié)。

? 靶向微生物調(diào)控減輕腸道屏障損傷，并且對(duì)IgA發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用

此外，作者進(jìn)一步探討了調(diào)節(jié)特定微生物群落對(duì)腸道屏障和黏膜免疫的影響。結(jié)果顯示，COS干預(yù)組顯著改善了腸道通透性指標(biāo)。對(duì)D-LA和LPS的改善效果呈劑量依賴性，其中COS-H組的改善效果最佳。陽(yáng)性對(duì)照組也顯示出對(duì)IgAN模型引起的腸道損傷的改善。H&E染色還顯示，COS干預(yù)導(dǎo)致結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰完整，腸腺排列規(guī)則，趨于正?；?。

同時(shí)，COS干預(yù)緩解了IgAN模型中B細(xì)胞過(guò)度活化引起的IgA失衡。顯著降低了小鼠血清中BAFF（COS-L組，p?<??0.001；COS-H組，p?<?0.001）和APRIL（COS-L組，p?<?0.001；COS-H組，p?<?0.001）的水平。COS-H組的IgA水平顯著降低（p?<?0.05）。總結(jié)來(lái)說(shuō)，針對(duì)IgAN中特定微生物群落的靶向調(diào)節(jié)可抑制APRIL和BAFF的過(guò)表達(dá)，從而對(duì)IgA發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

? IgAN患者糞菌移植會(huì)引起模型小鼠產(chǎn)生腎損傷

采用人類微生物群相關(guān)HMA-IgAN小鼠模型探討小鼠模型與人類微生物群的差異，并計(jì)劃驗(yàn)證IgAN誘導(dǎo)的人體腸道微生物群演變對(duì)小鼠腎功能的影響。腎免疫熒光顯示，HMA-IgAN小鼠腎小球IgA（p?<?0.01）、C3（p?<?0.01）和IgG（p?<?0.001）沉積與IgAN模型小鼠觀察到的結(jié)果相似。PAS染色顯示，HMA-IgAN小鼠腎小球系膜細(xì)胞顯著增生伴炎性浸潤(rùn)，與IgAN模型組相似。與HMA-HC組相比，HMA-IgAN小鼠表現(xiàn)出與IgAN模型相似的腎損傷，血尿素氮（BUN，p?<?0.05）、尿酸（UA，p?<??0.05）、血肌酐（Scr，p?<?0.001）和尿白蛋白/肌酐比（ACR，p?<?0.01）顯著升高。

這些結(jié)果表明，IgAN狀態(tài)下的腸道微生物群可誘導(dǎo)成功構(gòu)建IgAN小鼠模型，并導(dǎo)致宿主腎損傷，其損傷程度與IgAN小鼠模型觀察到的損傷相當(dāng)。

? HMA-IgAN小鼠模型重現(xiàn)了腸道菌群失調(diào)

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：與HMA-HC組相比，HMA-IgAN組小鼠腸道微生物群的α多樣性顯著降低。β多樣性分析顯示，兩組的聚類之間存在明顯的分化。兩組的微生物群特征也存在顯著差異。在屬水平上，HMA-IgAN小鼠表現(xiàn)出擬桿菌屬（Bacteroides）、未培養(yǎng)的擬桿菌目細(xì)菌（uncultured?Bacteroidales?bacterium）、丹毒絲菌屬（Erysipelatoclostridium）和厭氧梭菌屬（Anaerofustis）的增加。相對(duì)應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，以上結(jié)果表明，HMA-IgAN小鼠模型可以誘導(dǎo)腸道微生物群多樣性（ACE、Shannon和Chao1指數(shù)）的紊亂以及微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。

? COSF增加了HMA-IgAN小鼠模型腸道菌群多樣性，并且維持了腸道穩(wěn)態(tài)

最后，作者在IgA腎?。↖gAN）小鼠模型中，進(jìn)一步給予COS和COSF（殼寡糖制劑）進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，COS和COSF干預(yù)皆顯著增加了HMA-IgAN小鼠腸道微生物群的α多樣性指數(shù)，從而增加了腸道微生物群的豐富度。聚類結(jié)果顯示，HMA-IgAN組的樣本與對(duì)照組和干預(yù)組的樣本明顯分離，干預(yù)組樣本傾向于與對(duì)照組相似。采用LEfSe分析比較了HMA-HC組、HMA-IgAN組、COS干預(yù)組和COSF干預(yù)組之間的差異微生物群，并鑒定了各組的差異微生物群。在屬水平，COS可富集雙歧桿菌（Bifidobacterium）和羅斯氏菌（Roseburia）。COSF組富集的微生物群包括普氏菌（Alistipes）、未分類的振蕩螺菌科（Oscillospiraceae）、臭味桿菌（Odoribacter）、里肯氏菌（Rikenella）和未培養(yǎng)的瘤胃菌。

相對(duì)應(yīng)的種水平豐度也發(fā)生了顯著的升高或降低，結(jié)合前期介紹的IgAN模型組COS干預(yù)后的微生物變化，可得出結(jié)論：COS和COSF能夠平衡兩個(gè)模型中特定微生物群的失調(diào)。

? COSF可改善HMA-IgAN小鼠模型的腎功能修復(fù)

最后作者發(fā)現(xiàn)COS與COSF（殼寡糖制劑）皆顯著改善了HMA-IgAN小鼠模型的各項(xiàng)腎功能指標(biāo)，顯著降低了UA（p?<?0.05）、Scr（p?<?0.01）、BUN（p?<?0.05）和ACR（p?<?0.001）水平。

腎小球PAS染色結(jié)果顯示，COS和COSF干預(yù)顯著降低了IgA（COS,?p?<??0.001;?COSF,?p?<?0.001）、C3（COS,?p?<?0.05;?COSF,?p?<?0.01）和IgG（COS,?p?<?0.01;?COSF,?p?<?0.01）的沉積，并對(duì)系膜細(xì)胞增殖和基質(zhì)擴(kuò)張具有明顯的抑制作用，其中COSF組在腎小球系膜區(qū)增殖方面顯示出更顯著的改善。

總結(jié)來(lái)說(shuō)，COSF干預(yù)可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)HMA-IgAN小鼠模型內(nèi)的特定微生物群落來(lái)增強(qiáng)腎功能。

研究總結(jié)

該研究采用IgAN和人類微生物群相關(guān)模型來(lái)研究IgAN對(duì)腸道微生物群改變的影響以及腸道微生物群的可能會(huì)觸發(fā)?IgAN的機(jī)制。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了殼聚糖?（COS）和COS制劑（COSF）具有微生物群靶向功能，可增強(qiáng)腸道屏障和腎功能的作用。這些結(jié)果表明，IgAN可導(dǎo)致α多樣性降低和腸道微生物群的結(jié)構(gòu)改變。同時(shí)，腸道也出現(xiàn)了B細(xì)胞免疫失衡和緊密連接蛋白水平降低（ZO-1和Occludin）。而COS/COSF可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)富集腸道屏障和粘膜免疫相關(guān)微生物群來(lái)增強(qiáng)腸道ZO-1表達(dá)，減少B細(xì)胞活化因子（BAFF）和增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）過(guò)表達(dá)，從而減少IgAN中的腎損傷。

總之，該研究證明了部分腸道菌群與IgAN的之間的機(jī)制關(guān)系，為開(kāi)發(fā)針對(duì)微生物群的食物干預(yù)措施改善IgAN提供科學(xué)依據(jù)。

以上內(nèi)容來(lái)源于網(wǎng)絡(luò)，侵刪

該研究揭示甘露糖富集的Cetobacterium?somerae能將日糧中的精氨酸在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為腐胺，并由肝臟進(jìn)一步代謝為亞精胺，從而發(fā)揮減輕高脂日糧誘導(dǎo)的肝脂蓄積的作用，這一發(fā)現(xiàn)不僅闡明了腸道微生物與宿主之間跨界協(xié)同產(chǎn)生有益代謝物的全新機(jī)制，也為理解腸肝軸在代謝健康中的作用提供了突破性視角。百邁客生物為該研究提供了全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序服務(wù)。

研究背景

最新研究發(fā)現(xiàn)腸-肝軸涉及兩個(gè)器官間的相互作用，能通過(guò)多種微生物代謝物實(shí)現(xiàn)的雙向交流，表明腸道來(lái)源的細(xì)菌代謝物可能對(duì)肝臟健康產(chǎn)生正向或負(fù)向影響。為探究腸-肝相互作用，高脂飲食（HFD）模型是最成熟的實(shí)驗(yàn)方法之一，腸道、微生物群與宿主肝臟之間的這種特殊相互作用表明腸道微生物可能產(chǎn)生許多尚未表征的代謝物，這些代謝物可循環(huán)至肝臟以影響肝功能。然而，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)任何腸道微生物代謝物經(jīng)肝臟代謝后轉(zhuǎn)化為有益于肝臟健康的成分。

研究結(jié)果

甘露糖補(bǔ)充緩解斑馬魚(yú)高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝

因?yàn)橐延袌?bào)道表明甘露糖可改變腸道菌群組成并緩解小鼠脂肪肝，為了確定通過(guò)甘露糖富集或選擇腸道菌群是否能改善肝功能，進(jìn)行了添加甘露糖的HFD喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。喂養(yǎng)試驗(yàn)后，?HFD組斑馬魚(yú)的體重增長(zhǎng)和肝臟三酰甘油（TAG）含量較正常脂肪飲食（NFD）組顯著增加，表明成功建立了營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝模型。與HFD組相比，NFD、5M（5?g/kg）和10M（10?g/kg）組通過(guò)降低肝臟脂合成相關(guān)基因的表達(dá)，肝臟TAG含量顯著降低，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平顯著下降。H&E染色顯示，相比HFD組，5M和10M組肝臟的空泡數(shù)量和損傷評(píng)分明顯減少。5M和10M組肝臟促炎因子相關(guān)基因的表達(dá)也有所降低，總體而言，還觀察到HFD添加甘露糖后在形態(tài)學(xué)和分子水平上改善了斑馬魚(yú)的腸道健康。

圖1-甘露糖補(bǔ)充不能直接緩解HFD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性，但會(huì)促進(jìn)C.somerae的生長(zhǎng)

甘露糖補(bǔ)充改變腸道微生物群并選擇性富集CETOBACTERIUM

與HFD組相比，5M組和10M組中變形菌門(mén)（Proteobacteria）的相對(duì)豐度顯著降低，而梭桿菌門(mén)（Fusobacteriota）的相對(duì)豐度顯著增加。與HFD組相比，5M組和10M組中梭桿菌屬（Cetobacterium）的相對(duì)豐度顯著增加。腸道微生物群的α多樣性指數(shù)（Chao1和Shannon）在各組間無(wú)顯著差異。LEfSe分析顯示，5M組斑馬魚(yú)腸道中梭桿菌屬（Cetobacterium）高度富集。梭桿菌屬（Cetobacterium）是梭桿菌門(mén)（Fusobacteriota）的一個(gè)屬，在魚(yú)類中僅由單一物種C.?somerae代表，該菌通常棲息于多種魚(yú)類的腸道中。

此外，PCoA顯示HFD組和5M組的腸道微生物群完全分離，表明甘露糖補(bǔ)充顯著改變了斑馬魚(yú)的腸道微生物群組成。Spearman相關(guān)性分析顯示，變形菌門(mén)及其包含的近緣單胞菌屬（Plesiomonas）和氣單胞菌屬（Aeromonas）的相對(duì)豐度與TAG含量呈顯著正相關(guān)，而梭桿菌門(mén)（Fusobacteriota）和梭桿菌屬（Cetobacterium）的相對(duì)豐度與肝臟甘油三酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Cetobacterium、Plesiomonas和Aeromonas的豐度與肝臟TAG含量的關(guān)系，收集了斑馬魚(yú)和鯉魚(yú)的公共數(shù)據(jù)集。Spearman相關(guān)分析顯示，Cetobacterium與肝臟TAG含量呈一致的顯著負(fù)相關(guān)，而Plesiomonas和Aeromonas則沒(méi)有。

對(duì)C.?SOMERAE的基因組與生長(zhǎng)分析揭示其代謝甘露糖的能力

為探究甘露糖補(bǔ)充后腸道中這些不同細(xì)菌類群豐度變化的原因，該團(tuán)隊(duì)對(duì)斑馬魚(yú)腸道中選定的菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析，包括C.?somerae?XMX-1,?Plesiomonas?shigelloides?CB5?和Aeromonas?veronii??XMX-5。結(jié)果證實(shí)這些菌株存在顯著的功能差異。

首先，三種菌株的基因組結(jié)構(gòu)存在明顯差異。由于甘露糖喂養(yǎng)的斑馬魚(yú)腸道中Cetobacterium相對(duì)豐度較高，進(jìn)一步比較了這三種細(xì)菌對(duì)單糖代謝途徑的差異。結(jié)果顯示，只有C.somerae具有代謝甘露糖的能力，進(jìn)一步的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)C.somerae可利用甘露糖作為其生長(zhǎng)的主要碳源。相比之下，當(dāng)甘露糖作為主要碳源時(shí)，P.shigelloides?CB5和A.veronii?XMX?-5均未觀察到生長(zhǎng)。

腸道C.?SOMERAE可減少斑馬魚(yú)肝臟脂肪蓄積

為明確甘露糖或C.?somerae是否能減少肝臟脂肪積累，研究了甘露糖對(duì)無(wú)菌（GF）斑馬魚(yú)肝臟脂肪積累的直接影響。結(jié)果證實(shí)，補(bǔ)充甘露糖的飲食并未減少肝臟脂肪積累，且與脂質(zhì)代謝和炎癥因子相關(guān)的基因表達(dá)未出現(xiàn)顯著變化。

然而，甘露糖改善的腸道菌群可減少斑馬魚(yú)肝臟脂肪積累。隨后，為直接驗(yàn)證C.?somerae補(bǔ)充對(duì)降低肝臟脂質(zhì)積累的影響，在喂食HFD的GF斑馬魚(yú)幼體中添加了濃度為106?CFUs/g的C.?somerae。與HFD組相比，補(bǔ)充C.?somerae的組別肝臟TAG含量和油紅染色顯著降低。C.?somerae對(duì)宿主的保護(hù)作用已在脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)基因中得到證實(shí)。

此外，團(tuán)隊(duì)評(píng)估了P.?shigelloides?CB5或A.?veronii?XMX-5對(duì)肝臟降脂效果，證實(shí)這些菌株不影響斑馬魚(yú)肝臟脂肪含量。最后，發(fā)現(xiàn)C.?somerae可改善斑馬魚(yú)肝臟脂肪積累和腸道健康。

代謝組與基因組分析揭示了C.?SOMERAE中精氨酸-腐胺通路的存在

為探究C.?somerae可HFD下改善宿主肝臟健康的機(jī)制，結(jié)合基因組學(xué)和代謝組學(xué)分析以及同位素示蹤方法，來(lái)確定C.?somerae參與降低肝臟脂肪含量的活性成分。代謝組分析顯示，無(wú)菌培養(yǎng)基和C.?somerae上清液中的代謝物顯著分離，且組內(nèi)差異性較低。差異代謝物分析表明，腐胺是C.?somerae上清液中最豐富的代謝物之一。隨后團(tuán)隊(duì)基于C.?somerae的基因組序列注釋了腐胺代謝途徑中的主要酶，并發(fā)現(xiàn)C.?somerae擁有編碼精氨酸脫羧酶的基因，以及胍丁胺脫亞胺酶和N-氨甲酰腐胺酰胺酶的基因，從而從胍基丁胺中產(chǎn)生腐胺，這與其他細(xì)菌的研究結(jié)果一致。

此外，C.?somerae的全譜代謝組分析顯示，該細(xì)菌可利用精氨酸產(chǎn)生胍基丁胺并進(jìn)一步產(chǎn)生腐胺。進(jìn)一步的靶向代謝組分析表明，精氨酸在48小時(shí)被C.?somerae完全利用，腐胺含量達(dá)到2.22?μmol/mL。為驗(yàn)證該代謝途徑在C.?somerae中的存在，我們?cè)谂囵B(yǎng)基中添加了外源性同位素標(biāo)記的13C6?15N4-精氨酸。結(jié)果顯示，C.?somerae的上清液和細(xì)菌沉淀中均檢測(cè)到13C4?15N2-腐胺。最后，通過(guò)向培養(yǎng)基中補(bǔ)充D8-腐胺，驗(yàn)證C.?somerae是否能進(jìn)一步代謝腐胺生成亞精胺。結(jié)果表明，C.?somerae的上清液和細(xì)菌沉淀中均檢測(cè)到D8-腐胺，但未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的亞精胺。綜合分析表明，C.?somerae可通過(guò)精氨酸代謝途徑產(chǎn)生腐胺，該代謝物可能具有降低肝臟脂質(zhì)的潛在作用。

圖2-亞精胺是改善HFD誘導(dǎo)性肝脂肪變性的效應(yīng)分子

腐胺對(duì)肝功能無(wú)直接影響，但其下游宿主代謝產(chǎn)物精脒可緩解脂肪肝病理改

亞精胺作為腐胺的下游代謝產(chǎn)物，已被證實(shí)可緩解肝臟脂肪變性，但未在C.somerae基因組中發(fā)現(xiàn)亞精胺合成酶（srm）基因，且在細(xì)菌上清液中也未檢測(cè)到該酶。此外，在C.somerae培養(yǎng)物的任何組分中均未檢測(cè)到13C415N2-亞精胺到D8-亞精胺。檢測(cè)了斑馬魚(yú)基因組，發(fā)現(xiàn)其確實(shí)存在可將腐胺代謝為亞精胺的亞精胺合成酶（EC:2.5.1.16）基因。采用斑馬魚(yú)肝臟（ZFL）細(xì)胞模型進(jìn)行的同位素示蹤實(shí)驗(yàn)顯示，?ZFL?細(xì)胞中檢測(cè)到總亞精胺中有57.78%為D8-亞精胺，表明?ZFL?細(xì)胞能夠?qū)8-腐胺代謝D8-亞精胺。

隨后研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)ZFL的HFD模型驗(yàn)證腐胺和亞精胺是否會(huì)影響肝臟脂質(zhì)代謝。與對(duì)照組相比，腐胺和亞精胺處理的?ZFL?細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量顯著降低。為驗(yàn)證亞精胺對(duì)肝功能的影響，在ZFL細(xì)胞和斑馬魚(yú)幼體中敲低了亞精胺合成酶。沉默亞精胺合成酶后，腐胺處理組的降脂效果消失，而亞精胺處理組仍保持該效應(yīng)。

HFD斑馬魚(yú)中腐胺-亞精胺交叉對(duì)話的發(fā)現(xiàn)

為驗(yàn)證腸道微生物產(chǎn)生的腐胺是否可轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟作為亞精胺合成的前體，體內(nèi)同位素示蹤實(shí)驗(yàn)顯示：腸道中的D8-腐胺可通過(guò)血液轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，且肝臟可將84.50%的D8-腐胺代謝為D8-亞精胺，肝臟中亞精胺含量顯著高于腐胺。通過(guò)斑馬魚(yú)HFD模型進(jìn)一步驗(yàn)證了腐胺與亞精胺的降脂作用：與HFD組相比，腐胺和亞精胺處理組的肝臟甘油三酯含量均顯著降低；兩組肝臟中腐胺與亞精胺水平均恢復(fù)至正常水平。補(bǔ)充甘露糖和C.?somerae的實(shí)驗(yàn)組亦證實(shí)此結(jié)果，表明肝臟是腐胺轉(zhuǎn)化為亞精胺的主要代謝場(chǎng)所。

研究總結(jié)

該研究發(fā)現(xiàn)了一種涉及精氨酸-腐胺-亞精胺級(jí)聯(lián)代謝途徑的新機(jī)制，該機(jī)制通過(guò)腸道C.?somerae與宿主肝臟的協(xié)同作用改善肝臟脂肪變性。關(guān)于腸道-肝臟軸中微生物-宿主代謝相互作用產(chǎn)生有用代謝物亞精胺的新發(fā)現(xiàn)，提出了腸道-肝臟軸中宿主-微生物交叉對(duì)話的新概念。

中文題目：5-ASA的腸道微生物代謝降低了其在炎癥性腸病中的臨床療效

發(fā)表期刊：nature medicine

發(fā)表時(shí)間：2023

影響因子：82.9

研究背景

炎性腸病 (IBD)是一種慢性、使人虛弱的胃腸疾病，治療失敗率較高。目前尚無(wú)系統(tǒng)的方法預(yù)測(cè)對(duì)IBD療法的反應(yīng)?？寡姿幬锩郎忱海脖环Q為5-氨基水楊酸 (5-ASA)，是IBD最常用的處方療法之一，通常在結(jié)腸內(nèi)發(fā)揮作用；然而，隨著時(shí)間的推移，超過(guò)一半的IBD患者對(duì)5-ASA沒(méi)有反應(yīng)或最終失去反應(yīng)。因此，有必要確定并消除此類治療失敗的原因。

研究思路

研究重點(diǎn)

1、來(lái)自IBD患者的多組學(xué)研究確定了5-ASA的使用

利用人類微生物組項(xiàng)目炎癥性腸病多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（IBDMDB，http://ibdmdb.org），對(duì)79名克羅恩?。–D）或潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的糞便樣本進(jìn)行多組學(xué)分析，共鑒定了1036個(gè)宏基因組（MGX）、440個(gè)元轉(zhuǎn)錄本（MTX）和508個(gè)非靶向代謝組（MBX），以及283個(gè)MBX-MGX對(duì)和213個(gè)MGX-MTX對(duì)。隨后針對(duì)13名新使用5-ASA的患者來(lái)確定5-ASA在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)的特定糞便代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈顯著差異，且經(jīng)5-ASA治療后，賴氨酸合成途徑中的細(xì)菌代謝產(chǎn)物—2-氨基己二酸的含量減少，煙酸代謝也發(fā)生了顯著變化。

進(jìn)一步評(píng)估微生物、宿主和其他因素對(duì)這些差異顯著的代謝物的相對(duì)貢獻(xiàn)，最終發(fā)現(xiàn)5-ASA的藥物水平在確定5-ASA調(diào)節(jié)代謝物水平方面具有最大的預(yù)測(cè)能力（35%），其次是微生物組特征（15%）和其他宿主因素（7%）。隨后，通過(guò)另一個(gè)獨(dú)立的IBD患者隊(duì)列中鑒定并驗(yàn)證了兩種可能的5-ASA衍生物—N-丙酰基5-ASA和N-丁?；?-ASA，它們的變化可以部分地由腸道微生物組來(lái)解釋。

圖1?5-ASA可直接影響糞便代謝組，并通過(guò)微生物組進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化

2、5-ASA代謝腸道微生物酶的鑒定

接下來(lái)確定參與5-ASA生物轉(zhuǎn)化的腸道微生物酶。首先對(duì)服用及未服用5-ASA的患者微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，最終鑒定了兩個(gè)顯著過(guò)表達(dá)的具有推定乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四個(gè)具有乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的候選基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。隨后將糞便樣本分為N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/陰性水平兩組，計(jì)算與N-乙酰5-ASA相關(guān)的每個(gè)元轉(zhuǎn)錄組基因簇的敏感性和特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了另外7個(gè)假定的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因簇與使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相關(guān)。最終得到的12個(gè)之前未被表征的候選乙酰轉(zhuǎn)移酶可分為硫解酶和?；o酶A N-酰基轉(zhuǎn)移酶兩組，其中?；o酶A NAT家族比硫解酶家族表現(xiàn)出更大的序列異質(zhì)性，且?；o酶A NAT酶幾乎都來(lái)自擬桿菌門(mén)，而硫解酶來(lái)自厚壁菌門(mén)。通過(guò)研究菌株水平的基因組，同樣發(fā)現(xiàn)了一部分普氏鐮孢菌株編碼相關(guān)的乙酰轉(zhuǎn)移酶。

圖2N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和?；o酶A N-乙酰轉(zhuǎn)移酶

3、5-ASA失活酶生化特性的推定

為了推測(cè)硫解酶和?；o酶A NAT超家族具有潛在的5-ASA滅活能力，選用來(lái)自厚壁菌門(mén)的候選硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和來(lái)自福氏假單胞菌的酰基輔酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于進(jìn)一步的生化表征。用已知的腸道鏈球菌酶作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)乙酰化5-ASA采用體外質(zhì)譜分析，最終證實(shí)了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii?；o酶A NAT具有使用乙酰輔酶A乙?；?-ASA的能力。

隨后測(cè)試了硫解酶對(duì)其他含胺基異生素（包括5-ASA異構(gòu)體4-ASA、異煙肼、普魯卡因胺和肼屈嗪）的乙酰化活性，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這些化合物的任何乙?；@表明了硫解酶的底物選擇性。此外，編碼第二個(gè)預(yù)測(cè)的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培養(yǎng)物也能夠?qū)?-ASA乙?；癁镹-乙酰基5-ASA。

為了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙?；?-ASA，將FcTHL的乙酰化未配體晶體結(jié)構(gòu)疊加在乙?；蚪饷妇w結(jié)構(gòu)上，與來(lái)自充分表征的革蘭氏陰性分枝菌（ZrTHL）的乙酰輔酶A復(fù)合。隨后將FcTHL與NAT (PDB ID: 2PFR)的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位點(diǎn)是否類似于腸道鏈球菌NAT的活性位點(diǎn)，最終揭示了活性位點(diǎn)區(qū)域中的半胱氨酸和組氨酸三聯(lián)體。

圖3?5-ASA在體外的乙?；钚缘淖C實(shí)

4、IBD治療失敗與5-ASA代謝酶的宏基因組攜帶有關(guān)

基于臨床服用5-ASA的個(gè)體差異性，接下來(lái)檢查12種乙酰轉(zhuǎn)移酶的存在是否與5-ASA治療失敗有關(guān)。收集39名在任何時(shí)間點(diǎn)接受5-ASA治療及使用類固醇患者的609份糞便樣本，使用多變量邏輯回歸模型，調(diào)整與疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)了因素-年齡、性別、吸煙狀況和IBD亞型，納入每個(gè)參與者的NAT2表型來(lái)解釋宿主遺傳，最終發(fā)現(xiàn)糞便樣本中存在4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因與類固醇起始風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因有三種來(lái)自硫解酶超家族，一種來(lái)自?；o酶A超家族。且較早的發(fā)病年齡和CD與UC狀態(tài)相比，同樣與開(kāi)始使用類固醇的更高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。但未發(fā)現(xiàn)類固醇使用風(fēng)險(xiǎn)和大腸桿菌NAT的宏基因組存在聯(lián)系。

在敏感性分析中，微生物乙酰轉(zhuǎn)移酶基因數(shù)量的增加與類固醇起始風(fēng)險(xiǎn)的增加顯著相關(guān)；從未使用過(guò)5-ASA治療的患者基因家族與類固醇的使用沒(méi)有正相關(guān)。隨后使用混合效應(yīng)模型對(duì)參與者進(jìn)行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)存在三個(gè)或更多乙酰轉(zhuǎn)移酶基因也與類固醇使用風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)，這在隨后在未使用類固醇的208名5-ASA使用者隊(duì)列中得到了驗(yàn)證。

圖4腸道微生物5-ASA滅活乙酰轉(zhuǎn)移酶與5-ASA使用者治療失敗的更大風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)

研究總結(jié)

本研究結(jié)果首次提供了特異性腸道代謝酶與IBD 5-ASA治療失敗之間的直接聯(lián)系，從而產(chǎn)生了直接的臨床潛力。5-ASA是UC最常用的處方藥。為了保持有效，它必須以未修飾的形式存在于結(jié)腸腔中，因此，與其他藥物不同，它在小腸中的吸收很差。5-ASA治療失敗的個(gè)體通常進(jìn)展為風(fēng)險(xiǎn)更高的免疫抑制治療，而只有在必要時(shí) (即腸道微生物組中存在修飾5-ASA的硫解酶序列)才有能力這樣做，這將為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供有價(jià)值的生物標(biāo)志物。此外，闡明微生物失活5-ASA的酶學(xué)機(jī)制可能有助于未來(lái)研發(fā)微生物特異性酶抑制劑，以增強(qiáng)5-ASA的療效。在本研究中，我們的數(shù)據(jù)是觀察性的；需要更多的介入研究來(lái)加強(qiáng)我們的發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是通過(guò)在IBD患者中的臨床試驗(yàn)還是通過(guò)單定植小鼠。目前，這些發(fā)現(xiàn)為IBD的個(gè)性化微生物醫(yī)學(xué)打開(kāi)了一扇概念之窗。