1.1?植物組織：CTAB法

1. 液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2. 向離心管中加入 CTAB，水浴
3. 離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4. 向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
6. 晾干，加入 TE ?溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2?動(dòng)物組織：SDS法

1. 液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2. 加入 SDS 溶液，水浴
3. 加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4. 向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5. 向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
7. 晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3?動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101

1.4?粗體核酸純化

試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10223

試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10243

1.5?微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測(cè)方法

2.1?檢測(cè)方法

• 濃度檢測(cè)

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000

Qubit：廠家YEASEN, 型號(hào)CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit

• 完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600

電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120

2.2?判定標(biāo)準(zhǔn)

• 總量≥2μg（單次建庫(kù)）
• 濃度≥50ng/ul
• 體積≥10(ul)
• OD260/280在7-2.2之間，OD260/230在1.0-3.0之間
• AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無或有輕微污染，N/Q在8-2.5之間
• 樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)

3、建庫(kù)方法

3.1?建庫(kù)流程

1. 準(zhǔn)備高質(zhì)量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化
2. 使用BluePippin進(jìn)行片段篩選
3. 使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加 A
4. 使用無擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒添加 barcode 序列
5. 使用無擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒完成測(cè)序接頭的連接

3.2?建庫(kù)試劑

• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext FFPE DNA Repair Mix貨號(hào)?M6630L 廠家?NEB
• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module貨號(hào)E7546L ?廠家NEB
• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：無擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒1-96 ?貨號(hào)SQK-NBD114.96 廠家Nanopore

3.3?建庫(kù)設(shè)備

• 數(shù)字 3*32PCR 儀??廠家?Appliedbiosystems???儀器規(guī)格?proflex3*32
• 制冷型程控五段金屬浴??廠家?天根生化科技（北京）有限公司??儀器規(guī)格?OSE-DB-02

4、測(cè)序方法

4.1?上機(jī)操作

• 用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix
• 用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫(kù)
• 用 PromethION ?Flow ?Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)

4.2?測(cè)序試劑

• 測(cè)序芯片制備試劑盒??貨號(hào)?EXP-FLP004 ??廠家?Nanopore
• 測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒??貨號(hào)?EXP-AUX003 ?廠家?Naonopore
• 測(cè)序芯片??PromethION Flow Cell(R10.4.1)??貨號(hào)?FLO-PRO114M ??廠家?Nanopore

4.3?測(cè)序設(shè)備

PromethION48 測(cè)序儀??廠家?Nanopore???儀器規(guī)格?PromethION48

發(fā)表期刊：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)

發(fā)表時(shí)間：2020年11月

影響因子：2.302

研究背景

蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis，簡(jiǎn)稱球囊菌）是專性侵染蜜蜂幼蟲的致死性真菌病原，引發(fā)的白堊病是長(zhǎng)期危害養(yǎng)蜂生產(chǎn)的頑疾，不僅可導(dǎo)致蜜蜂幼蟲的大量死亡，還能導(dǎo)致成年蜜蜂數(shù)量的銳減以及蜂群群勢(shì)和蜂產(chǎn)品產(chǎn)量的驟降。目前，球囊菌的基因組注釋信息尚不完善，高質(zhì)量參考轉(zhuǎn)錄組匱乏，嚴(yán)重限制了球囊菌的組學(xué)和分子生物學(xué)研究。

材料和方法

球囊菌菌株由福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）蜜蜂保護(hù)實(shí)驗(yàn)室分離、純化和保存。純化得到的純凈菌絲樣品和孢子樣品經(jīng)液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移到-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩＠眉{米孔長(zhǎng)讀段測(cè)序技術(shù)對(duì)球囊菌的純化菌絲（Aam）和純化孢子（Aas）分別進(jìn)行測(cè)序，將高質(zhì)量的三代測(cè)序數(shù)據(jù)混合后用于構(gòu)建全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，并通過比對(duì)主流數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，同時(shí)對(duì)球囊菌的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）進(jìn)行鑒定和分析。

結(jié)果

1、納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

球囊菌菌絲和孢子的納米孔測(cè)序分別得到6321704和6259727條原始讀段，N50分別達(dá)到1094和1157bp，平均長(zhǎng)度分別為992和1047bp，長(zhǎng)的長(zhǎng)度分別為9421和13060bp（表1）。來源于Aam和Aas的原始讀段的長(zhǎng)度分布介于1-10kb以上，其中分布reads數(shù)多的長(zhǎng)度均為1kb（圖1-A、1-B）；原始讀段的Q值分布介于Q6-Q15，分布reads數(shù)多的質(zhì)量值分別為Q9和Q11（圖1-C、1-D）。

圖1球囊菌菌絲和孢子納米孔長(zhǎng)讀段測(cè)序的原始讀段長(zhǎng)度和質(zhì)量值分布Fig.1Lengthandqualitydistributionofrawreadsgeneratedfromnanoporelong-readsequencingofA.apismyceliumandspore

2、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的鑒定和分析

進(jìn)一步過濾冗余全長(zhǎng)有效讀段，分別得到9859和16795條非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，N50分別達(dá)到1482和1658bp，平均長(zhǎng)度分別達(dá)到1187和1303bp，長(zhǎng)的長(zhǎng)度分別為6472和6815bp（表2）；上述非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度介于1-7kb，其中分布在1kb的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)多。進(jìn)一步對(duì)Aam和Aas的非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行Venn分析，結(jié)果顯示有6512個(gè)非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為菌絲和孢子所共有，分別有3347和10283個(gè)非冗余全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本為二者特有（圖2-A）。

圖2球囊菌菌絲和孢子全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的Venn分析(A)、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋（B）Fig.2Vennanalysisoffull-lengthtranscriptsinA.apismyceliumandspore(A)、Nrdatabaseannotationoffull-lengthtranscripts(B)

3、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)據(jù)庫(kù)注釋

在球囊菌菌絲和孢子中共鑒定出20142條全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，分別有20809、11151、17723、12164、11340和9833全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本可注釋到Nr、KOG、eggNOG、Pfam、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。注釋全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量多的物種是球囊菌、Polytolypahystricis和莢膜組織胞漿菌（Histoplasmacapsulatum）（圖2-B）

4、lncRNA的鑒定及分析

利用CPC、CPAT、CNCI和Pfam4種方法依次鑒定出1906、1682、750和648條lncRNA，四者的交集為648個(gè)（圖3-A）；其中基因間區(qū)lncRNA（longintergenicRNA，lincRNA）、反義鏈lncRNA（anti-senselncRNA）和正義鏈lncRNA（senselncRNA）的數(shù)量分別為480、119和49個(gè)（圖3-B）。

圖 3 球囊菌 lncRNA 的數(shù)量（A）和種類（B） Fig. 3 Number (A) and type (B) of A. apis lncRNAs

總結(jié)

構(gòu)建和注釋了球囊菌的高質(zhì)量全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，為探究球囊菌轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性、完善參考基因組的序列和功能注釋信息以及深入開展球囊菌可變剪接體的功能研究提供了關(guān)鍵依據(jù)。

深度挖掘數(shù)據(jù)和拓展

同期作者利用納米孔全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)蜜蜂球囊菌（Ascosphaeraapis）和另一蜜蜂真菌病原東方蜜蜂微孢子蟲（Nosemaceranae）的現(xiàn)有參考基因組在結(jié)構(gòu)功能注釋上進(jìn)行了較好的完善，同時(shí)也對(duì)基因的可變剪接（alternativesplicing，AS）和可變多聚腺苷酸化（alternativepolyadenylation，APA）進(jìn)行解析。通過gffcompare軟件將全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本與參考基因組注釋的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較，對(duì)基因組注釋基因的非編碼區(qū)向上游或下游延伸，修正基因的邊界。利用MISA軟件鑒定長(zhǎng)度在500bp以上的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simplesequencerepeat，SSR）位點(diǎn)信息。使用Blast工具將鑒定到的新基因和新轉(zhuǎn)錄本比對(duì)Nr、KOG、eggNOG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，從而獲得功能注釋。通過Astalavista軟件鑒定基因的AS事件類型，統(tǒng)計(jì)分析可變剪切的結(jié)果。采用TAPISpipeline對(duì)基因的APA位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，得到APA的位點(diǎn)信息。分別利用CPC、CNCI、CPAT、Pfam4種方法對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）進(jìn)行預(yù)測(cè)，取四者的交集作為高可信度的lncRNA。研究結(jié)果較好地優(yōu)化了現(xiàn)有的東方蜜蜂微孢子蟲和蜜蜂球囊菌參考基因組已注釋基因的結(jié)構(gòu)和功能注釋信息，并補(bǔ)充和注釋了大量參考基因組未注釋的新基因和新轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)也為其他真菌的AS和APA研究提供了有益的思路和方法借鑒。

研究背景

在人腦中，與精神分裂癥相關(guān)的基因組區(qū)域富集了在神經(jīng)發(fā)育過程中表現(xiàn)出不同異構(gòu)體使用的基因，RNA剪接是將遺傳變異與精神疾病聯(lián)系起來的關(guān)鍵機(jī)制。剪接圖譜在大腦中特別多樣，很難準(zhǔn)確識(shí)別和量化。短讀長(zhǎng)RNA-Seq方法不能準(zhǔn)確地重建和定量大多數(shù)轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)異構(gòu)體，為解決這一挑戰(zhàn)，本文將long-range PCR和nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與一種新的生信分析流程結(jié)合。

CACNA1C是一種精神危險(xiǎn)基因，編碼電壓門控鈣通道CaV1.2，CACNA1C基因很大而且很復(fù)雜，至少有50個(gè)注釋外顯子和31個(gè)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄本。它的大小和復(fù)雜性使得用標(biāo)準(zhǔn)的基因表達(dá)方法準(zhǔn)確鑒定和量化轉(zhuǎn)錄本變得極其困難，本文在人腦中鑒定了CACNA1C的全長(zhǎng)編碼轉(zhuǎn)錄本，識(shí)別了38個(gè)新的外顯子和241個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本，對(duì)異構(gòu)體多樣性的詳細(xì)了解對(duì)于將精神病學(xué)基因組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為病理生理學(xué)見解和新的精神藥理靶點(diǎn)至關(guān)重要。

研究方法

樣本：來自利伯腦發(fā)育研究所儲(chǔ)存庫(kù)的三名成年捐贈(zèng)者的尸檢腦組織（提取小腦、紋狀體、背外側(cè)前額葉皮質(zhì)、扣帶回、枕葉和頂葉皮質(zhì)的RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄）
測(cè)序方法：使用PCR擴(kuò)增CACNA1C全長(zhǎng)CDS，使用MinION進(jìn)行測(cè)序
分析流程：https：//github.com/twrze/TAQLoRe

研究結(jié)果

1、CACNA1C有很多外顯子和異構(gòu)體

由于CACNA1C的復(fù)雜性，本文使用了兩種互補(bǔ)的方法來鑒定轉(zhuǎn)錄本：外顯子水平和剪接位點(diǎn)水平的分析，分析流程見補(bǔ)充圖2。該方法共鑒定了251種存在于人腦中獨(dú)特的CACNA1C轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，其中241種是新的，包括使用新的外顯子，新的剪接位點(diǎn)和連接。

補(bǔ)充圖2

在CACNA1C基因座內(nèi)總共注釋了39個(gè)潛在的新外顯子，其中38個(gè)在至少2個(gè)人或組織中被識(shí)別，并在每個(gè)文庫(kù)中得到至少5條nanopore reads的支持（圖2A）。通過PCR和Sanger測(cè)序確認(rèn)了新的外顯子與其周圍的注釋外顯子之間的剪接連接，從而驗(yàn)證了四個(gè)新的外顯子。這種新的外顯子的成功驗(yàn)證提供了很高的可信度，即通過納米孔測(cè)序鑒定的新的外顯子是真實(shí)的，并且被整合到CACNA1C轉(zhuǎn)錄本中。表達(dá)量最高的10條轉(zhuǎn)錄本中，有9條是新的且其中有8條被預(yù)測(cè)保持CACNA1C閱讀框架，這表明這些最豐富的新轉(zhuǎn)錄本中有一些編碼功能不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體（圖2B,C）。這些結(jié)果表明，新的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本表達(dá)豐富，數(shù)量也很多，目前的注釋缺少許多最豐富的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本。

圖2

通過設(shè)置轉(zhuǎn)錄本的高置信度，在6個(gè)大腦區(qū)域確定了90個(gè)高可信的CACNA1C轉(zhuǎn)錄本，包括7個(gè)先前注釋的(GENCODE V27)和83個(gè)新的(補(bǔ)充圖3)。7個(gè)新的高置信度轉(zhuǎn)錄本包含新的外顯子，而其余76個(gè)包含以前未描述的連接和連接組合。

補(bǔ)充圖3

上述外顯子水平的轉(zhuǎn)錄本鑒定方法為鑒定新的外顯子和表征全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)提供了穩(wěn)健和保守的手段。使用了更為保守的依賴于連接處無錯(cuò)誤映射所支持的連接的識(shí)別，以及規(guī)范剪接位點(diǎn)的方法，確定了497個(gè)新的剪接位點(diǎn)，其中393個(gè)由至少10條reads支持，這些剪接位點(diǎn)，在篩選了至少24條reads支持的轉(zhuǎn)錄本后，鑒定了195個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中111個(gè)被預(yù)測(cè)為編碼的。

2、CACNA1C亞型在不同腦區(qū)的表達(dá)譜不同

小腦、紋狀體與皮質(zhì)等組織觀察到了CACNA1C轉(zhuǎn)錄本差異，但在不同個(gè)體之間的表達(dá)是相似的。在小腦中觀察到了明顯的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)轉(zhuǎn)換；在小腦之外，ENST00000399641是主要的轉(zhuǎn)錄本，而在小腦中，ENST00000399641和CACNA1C n2199的表達(dá)水平相似。

圖3 C

3、預(yù)測(cè)新isoforms對(duì)CaV1.2蛋白模型的影響

CACNA1C編碼CaV1.2 的主要成孔亞基。鈣孔由24個(gè)跨膜重復(fù)序列組成，由細(xì)胞內(nèi)環(huán)連接成4個(gè)結(jié)構(gòu)域(I-IV)(圖4A)。在我們鑒定的83個(gè)新的外顯子水平的轉(zhuǎn)錄本中，51個(gè)可能編碼功能性的CaV1.2通道?；疑娇虮硎拘碌?、框架內(nèi)的插入和刪除的位置（值表示包含每個(gè)isoforms的reads的平均比例）。使用兩種分析方法（外顯子水平和剪切連接水平）鑒定變體的情況，外顯子水平計(jì)數(shù)用于得出豐度(紅色文本)；僅使用剪接位點(diǎn)水平方法鑒定的變體用藍(lán)色文本表示。包含三個(gè)微缺失的蛋白質(zhì)異構(gòu)體的數(shù)量：(I)在I-II接頭中，(Ii)在IV4-5接頭中，以及(Iii)在IV3-4接頭中先前報(bào)道的微缺失(圖4B)。

圖4

總結(jié)

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展為準(zhǔn)確獲得轉(zhuǎn)錄多樣性提供了可能，因?yàn)槊恳粭lread都包含一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄本。這對(duì)于具有復(fù)雜模型的基因尤其重要。由于CACNA1C剪接產(chǎn)生的CaV1.2蛋白對(duì)現(xiàn)有的鈣通道阻滯劑表現(xiàn)出不同的敏感性，因此有可能選擇性地針對(duì)疾病相關(guān)的CACNA1C亞型和/或那些在大腦與外周差異表達(dá)的CACNA1C亞型，提供既更有效又更無外周副作用的新型精神藥物。綜上，這些觀察結(jié)果證明了ONT長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序?qū)τ跍?zhǔn)確描述轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)和選擇性剪接的重要性。

參考文獻(xiàn)：
Clark Michael B,Wrzesinski Tomasz,Garcia Aintzane B et al. Long-read sequencing reveals the complex splicing profile of the psychiatric risk gene CACNA1C in human brain.[J] .Mol. Psychiatry, 2020, 25: 37-47.