三代微生物多樣性是基于?PacBio 測序平臺，利用單分子實時測序（SMRT Cell）的方法對 marker 基因進行測序，之后通過對 CCS（Circular Consensus Sequencing）序列過濾，得到 Optimization-CCS 進行 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類，并進行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品的物種構成； 進一步進行α多樣性分析（Alpha Diversity）、β多樣性分析（Beta Diversity）和顯著物種差異分析等等，可以挖掘?樣品之間的差異。

目前，微生物多樣性研究主要是于編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進行的。細菌主要是基于16S區(qū)，真菌主要基于18S區(qū)或ITS區(qū)（內轉錄間區(qū)），16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16S rRNA）的DNA序列，18S rDNA是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA（18S rRNA）的DNA序列，ITS是編碼真核生物核糖體小亞基rRNA的DNA內轉錄間隔區(qū)序列。這些序列中既有保守區(qū)又有可變區(qū)，保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關系，而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異。由于18S rDNA在進化速率上比較保守，在系統(tǒng)發(fā)育研究中較適用于種級以上階元的分類。常用作微生物分類研究的ITS分為ITS1和ITS2兩種。ITS1位于真核生物核糖體rDNA序列的18S和5.8S之間，ITS2位于真核生物核糖體rDNA序列5.8S和28S之間。由于ITS區(qū)在核糖體RNA加工過程中被剪切掉，不發(fā)揮功能作用，在進化過程中選擇壓力較小，進化速率約為18S rDNA的10倍，屬于中度保守的區(qū)域，利用它可研究種及種以下的分類階元。另外，也可通過選擇引物同時擴增18S rDNA和ITS，通過分析18S rDNA序列，先在較高級別上確定樣品的歸屬，然后根據(jù)ITS 序列，將真菌歸類到種或亞種水平。

我們對不同類型的樣品如：土壤、糞便、腸道、水體等，隨機挑選了30個項目對其進行物種注釋率進行研發(fā)優(yōu)化，目前采用優(yōu)化數(shù)據(jù)庫及注釋方法的策略，將其種水平平均注釋率提升到60%+。二代注釋到屬和種的平均比例為78%和6%，相同樣品采用三代進行注釋時，屬和種水平平均注釋率為95%和60%，注釋結果提升非常明顯。

測序數(shù)據(jù)量飽和度

基于PacBio SMRT單分子實時測序技術可以對DNA序列實現(xiàn)單分子級別的超長讀長測序，能夠輕易實現(xiàn)對環(huán)境樣品中rDNA/ITS/功能基因進行全長測序，不受制于短序列的局限性，提供了種甚至菌株水平的物種分辨率，更全面的解釋物種的多樣性。

統(tǒng)計數(shù)據(jù)結果顯示：單樣本5000條CCS即可達到飽和。

建庫測序：

提取樣品總 DNA 后，根據(jù) 16S 全長引物 27F 和 1492R（及其他全長引物），合成帶有 Barcode 的特異引物，進行 PCR 擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫（SMRT Bell），建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用 PacBio Sequel 進行測序。PacBio Sequel下機數(shù)據(jù)為 bam 格式,通過 smrtlink 分析軟件導出 CCS 文件, 根據(jù) Barcode 序列識別不同樣品的數(shù)據(jù)并轉化為 fastq 格式數(shù)據(jù)。

生信流程：

數(shù)據(jù)預處理：將 PacBio 下機數(shù)據(jù)導出為 CCS 文件( CCS 序列使用 Pacbio 提供的 smrtlink 工具獲取)后，主要有如下3個步驟：

1)CCS識別：使用?lima v1.7.0軟件，通過barcode對CCS進行識別，得到的Barcode-CCS序列數(shù)據(jù)；

2)CCS長度過濾：使用百邁客公司自主研發(fā)的軟件，對Barcode-CCS進行過濾，得到有效序列；

3)去除嵌合體：使用?UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到 Optimization-CCS 序 列。

信息分析內容：劃分OTU、多樣性及差異性分析（具體見分析結果）。

案例展示

案例一：

Bacterial compatibility and immobilization with biochar improved tebuconazole degradation, soil microbiome composition and functioning

發(fā)表時間：2020

合作單位：青島農業(yè)大學

發(fā)表期刊： Journal of Hazardous Materials

研究背景：戊唑醇殺菌劑是一種應用廣泛的殺菌劑，對水生生物和人類健康具有潛在威脅。微生物降解農藥是一種高效、低成本和環(huán)境友好的方法。本研究假設生物炭可能是降解戊唑醇細菌的理想載體，而固定化生物炭比自由施用的細菌可能加速戊唑醇從土壤中的去除。為了驗證這一點，我們以麥秸源生物炭為載體，利用戊唑醇降解菌WZ-2對污染土壤進行生物修復。

測序策略： Pacbio SequelII 全長16S測序

研究結論：菌株WZ-2和固定化生物炭的WZ-2加速了戊唑的降解，使戊唑在土壤中的半衰期分別從40.8天降低到18.7天和13.3天。雖然戊唑醇對土壤酶活性(脲酶、脫氫酶、轉化酶)和微生物群落結構有負面影響，但固定化生物炭的WZ-2不僅加速了戊唑醇的降解，而且恢復了土壤微生物酶活性和微生物群落組成。

案例二：

Arsenic exposure induces intestinal barrier damage and consequent activation of gut-liver axis leading to inflammation and pyroptosis of liver in ducks

發(fā)表時間：2021

合作單位：華南農業(yè)大學

發(fā)表期刊： Science of the Total Environment

研究背景：砷是一種重要的有害金屬，普遍存在于受污染的土壤、河流和地下水中。然而，關于三氧化二砷(ATO，砒霜)對水禽腸-肝軸的影響及其肝毒性的研究還很少。本研究探討了腸-肝軸在三氧化二砷誘導的肝毒性和腸道毒性中的作用。

測序策略：Pacbio SequelII 全長16S

測序 研究結論： ATO暴露可引起鴨腸道菌群α-多樣性顯著降低， 對照組中凸腹真桿菌、產硫球鏈菌、類腸膜魏斯氏菌和厭氧消化鏈球菌等更豐富。ATO暴露顯著降低腸道屏障相關蛋白的表達，導致腸道通透性增加和脂多糖水平升高；上調了肝臟和空腸的焦亡相關指數(shù)，并增加了促炎細胞因子的產生。進一步的機制研究表明，ATO誘導的肝臟和空腸炎癥是由LPS/TLR4/NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體的激活引起的。這些結果表明，ATO暴露可導致肝臟和空腸炎癥和焦亡，而間接的腸-肝軸通路可能在ATO誘導肝毒性的潛在機制中發(fā)揮重要作用。

我們的優(yōu)勢

• 1.PB全長多樣性測序基于HiFi模式對單一片段進行多輪測序的方式來提升準確性。由于Pacbio的原始錯誤為隨機錯誤，可通過獲取CCS進行自身糾正來提升數(shù)據(jù)的準確性。同一片段測序 5 次后，單一Read的準確性至少達到Q20（99%）。
• 2.全長序列中攜帶的特征信息更多，可以支持“種”水平的分辨率；
• 3.群落結構更準確，避免了短讀長擴增子的PCR引物選擇會影響推斷的群落準確性和某些細菌類群的敏感性；
• 4. CCS擴增子測序模式結合DADA2軟件算法，可獲得單堿基/近零錯誤率的全長rRNA基因序列。

常見問題