背景介紹

 

炎癥性腸?。↖BD）是一種由腸道微生物與腸道免疫系統(tǒng)相互作用異常而引發(fā)的慢性胃腸道炎癥。IBD包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D）兩種主要亞型，它們分別分布于大腸和小腸，且擁有各自獨特的微生物特征。研究表明，IBD患者的腸道微生物發(fā)生了巨大變化，與此同時，腸道微生物的代謝產(chǎn)物也能通過信號、免疫以及抗生素活性的途徑改變結(jié)腸環(huán)境。然而，腸道特異微生物與它們的分子產(chǎn)物如何通過相互作用來觸發(fā)、維持、減緩或預測IBD等炎癥狀況，我們目前仍不清楚。

短鏈脂肪酸（SCFAs）（如丁酸鹽、乙酸鹽和丙酸鹽）是腸道微生物分解膳食纖維產(chǎn)生的小分子化合物，它能通過調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；敢种苹钚?、基因表達、細胞增殖和免疫應答來影響宿主細胞。研究表明，IBD患者糞便中的丁酸鹽含量降低，而丁酸鹽可以通過調(diào)節(jié)Treg細胞的產(chǎn)生和增強巨噬細胞的活性預防結(jié)腸炎。共生微生物可以通過修飾代謝物改變宿主產(chǎn)生的信號分子。研究表明，腸道微生物產(chǎn)生的色氨酸脫氫酶能夠?qū)嬍持械纳彼徂D(zhuǎn)化為色胺和其他分子。在CD患者的腸道微生物中，色氨酸代謝基因有所下降；缺失IBD易感基因（CARD）動物的微生物色氨酸代謝發(fā)生了改變，導致宿主更易患結(jié)腸炎。

腸道微生物的16S擴增子測序與代謝組學研究表明，IBD患者的代謝物發(fā)生了變化且菌群多樣性普遍低于健康人群，與兒科IBD相關(guān)的腸道菌群也與代謝類型高度相關(guān)，糞便菌群結(jié)構(gòu)與非靶向代謝組的相關(guān)性比靶向代謝組高。總之，腸道代謝組中存在與炎癥和IBD相關(guān)的特征不明代謝物，這些代謝產(chǎn)物可能是由微生物衍生或修飾，非靶向模式為未知代謝物的捕獲提供了可能。

本研究采用非靶向的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS）技術(shù)和宏基因組技術(shù)，研究了IBD患者糞便樣品中的代謝組份和微生物的結(jié)構(gòu)與功能。

 

研究方法

 

1.? 樣本收集（糞便）：①PRISM（麻省總院IBD前瞻注冊試驗）：CD患者（68例），UC患者（53例），健康人群組（34例）（Fig. 1a）；②LifeLines DEEP和NLIBD（荷蘭北部人群前瞻研究，用于人群疾病的驗證）：CD患者（20例），UC患者（23例），荷蘭北部健康人群（22例）（圖1.a）。

2. 宏基因組學：①DNA提取試劑盒：QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAGEN)；②宏基因組建庫測序：Illumina Hiseq 2500，2.5G數(shù)據(jù)/樣品；③物種鑒定與功能注釋：MetaPhlAn2，HUMAnN2。

3. 代謝組學：4種LC-MS模式。

●?質(zhì)譜正離子模式（極性代謝物，如：有機酸）：10μl勻漿，90μl萃取液（乙腈/甲醇/甲酸74.9：24.9：0.2，v/v）），內(nèi)標（L-纈氨酸-d8和L-苯丙氨酸-d8），二氧化硅HILIC色譜柱（Waters）（150×2mm），流動相A（甲氨酸（10mM）和甲酸（0.1%）），流動相B（乙腈和甲酸（0.1%）），250μl /min流速，梯度洗脫（5%流動相A 保持1min，10min時提升至40%），全掃描分析模式（m/z：70-800，分辨率70000，獲取速率3Hz），質(zhì)譜參數(shù)（離子噴霧電壓3.5kV，毛細管溫度350℃，探頭溫度300℃，鞘氣40，輔助氣15，S-lens RF 40）。

●?質(zhì)譜負離子模式（極性代謝物）：30μl勻漿，120μl萃取液（80%甲醇），內(nèi)標（肌苷15N4、胸腺嘧啶-D4和甘膽酸鹽D4），Luna NH2色譜柱（Phenomenex），流動相A（乙酸銨（20mM）、銨水（20mM）），流動相B（氨水（10mM）/乙腈/甲醇（75/25），v/v），梯度洗脫（10%流動相A，至10min時至100%流動相A），全掃描分析模式（m/z：60-750，其余參數(shù)同上），質(zhì)譜參數(shù)（探頭溫度325℃，鞘氣55，其余參數(shù)同上）。

●?質(zhì)譜負離子模式（中極性代謝物，如：膽酸、自由脂肪酸）：30μl勻漿，90μl萃取液（甲醇），內(nèi)標（E2-d4），10μl進樣量，HSS T3色譜柱（Waters），流動相A（0.1%甲酸，水），流動相B（0.1%甲酸，乙腈），400μl /min流速，梯度洗脫（25%流動相A保存1min，至11min時至100%流動相B），全掃描分析模式（m/z：200-550，其余參數(shù)同上），質(zhì)譜參數(shù)（探頭溫度300℃，毛細管溫度320℃，鞘氣45，輔助氣10，S-lens RF 60）。

●?極性和非極性脂肪酸：10μl勻漿，190μl萃取液（異丙醇），內(nèi)標（1-十二烷基-十三酰-丙三醇-3膽堿磷酸），10μl進樣量，BEH C8色譜柱（Waters），流動相A（醋酸銨（10mM）/甲醇/甲酸95:5:0.1，v/v/v），流動相B（甲醇/乙酸99.9:0.1，v/v），450μl /min流速，梯度洗脫（80%流動相A保存1min，至2min時至80%流動相B，至7min時至100%流動相B并保持至10min），全掃描分析模式（m/z：200-1100，其余參數(shù)同上），質(zhì)譜參數(shù)（探頭溫度300℃，毛細管溫度300℃，鞘氣50，輔助氣15，S-lens RF 60）。

（圖1.a：樣本來源、類型及分析方法）

研究結(jié)果

 

1.? IBD患者的代謝組變化與炎癥有關(guān)

本研究從155例（PRISM）樣本中共檢測出8,000多種代謝物，這些代謝物在健康人群與CD患者之間差異較大，UC患者的代謝物與健康人群和CD患者均有一定程度相似（圖1.b）。糞便樣品中的鈣保護素與代謝物、菌群結(jié)構(gòu)變化的第一主軸（PCoA）相關(guān)性均較強（圖1.d.1e），UC患者的炎癥程度既與健康人群相似又與CD患者相似，表明UC患者之間的腸道菌群結(jié)構(gòu)與代謝組份差異較大。

（圖1.b-e：IBD與個體腸道微生物和代謝物的關(guān)聯(lián)性）

（圖2：IBD代謝物豐度熱圖，圖中顯示了2729種IBD（UC/CD）與健康組之間具有豐度差異的特征代謝物）

2.? IBD患者腸道代謝物的比較分析

本研究采用Benjamini-Hochberg FDR（q＜0.05）方法進行多重檢驗校正，在IBD患者檢測2729種豐度顯著差異的代謝物，其中1931種在IBD患者中顯著減少，224種在IBD患者中的顯著增多，505種在CD患者中明顯升高，僅69種只在UC患者中明顯增多（與圖1.b坐標軸中顯示的結(jié)果一致）（圖2）?；贖MDB注釋定義了代謝物類并重點研究了97類，其中8類顯著富集于CD患者，鞘脂類、甲亞胺酸和膽汁酸影響最大（圖3.a）；7類顯著富集于UC患者，苯乙酸酯含量略有升高（圖3.b）。IBD患者富集的膽酸包括膽酯（q=0.003）和鵝脫氧膽酸鹽（q=0.0002）（圖3.c），CD患者的次生膽汁酸（膽酸鈉和脫氧膽酸）發(fā)生了補充消耗（q=0.06，0.13），鞘磷脂和神經(jīng)酰胺在CD患者和UC患者中均明顯過多（q＜0.02）。多數(shù)代謝物類在IBD患者（CD和UC）中顯著減少（圖3.a.3.b），它們包括三萜、長鏈脂肪酸、苯基苯并二惡烷、膽固醇和三?；视停–54:6）（圖3.e.3.f）。另外，乳酸酯和泛酸酯（分子類無顯著差異）在IBD患者中分別顯著富集和減少（圖3.g.3.h）。

（圖3. IBD患者和健康人群的腸道代謝物富集比較）

3.? IBD患者的腸道代謝物模型

為了探究IBD患者腸道代謝物的生物模式，本文采用線性模型方法對2729種差異代謝物進行相似性聚類分析。結(jié)果表明，IBD患者“最大代謝物聚類簇”包含39種代謝產(chǎn)物，該聚類簇包含12種膽酸（推測）、17種未標記的代謝物、膽酯（圖4.a淺綠色三角形）以及鵝脫氧膽酸酯（圖4.a 深綠色三角形）；健康人群的“最大代謝物聚類簇”包含62種高豐度代謝分子，四吡咯和衍生物均顯著富集（圖4.b）。

（圖4. 基于豐度相關(guān)性的IBD患者代謝物聚類。FC，糞便鈣防御蛋白）

4.? IBD患者腸道菌群的“種”水平變化

基于Bray-Curtis算法的距離矩陣（PCoA）發(fā)現(xiàn)，CD患者與健康人群腸道菌群結(jié)構(gòu)差異較大，而UC患者與前兩者之間并無明顯的區(qū)別，UC患者組內(nèi)分布也較零散（圖1.c.1.e）。為了進一步探究，本文運用線性建模研究195個“種”水平微生物。在IBD患者與健康人群之間發(fā)現(xiàn)了50種差異豐度微生物，其中35種在IBD患者中豐度較高，Roseburia hominis、Dorea formicigenerans和Ruminococcus obeum在健康人群中富集最多。與很多IBD研究報道一致，IBD患者的微生物種類明顯減少，多樣性普遍降低?！胺N”水平未分類的Roseburia（氏菌屬）在UC和CD患者中顯著富集，Bifidobacterium breve和Clostridium symbiosum僅富集于UC患者，CD患者具有20種獨特且豐富的菌（如R. gnavus、Escherichia coli和Clostridium clostridioforme）（圖5）。

（圖5. IBD患者“種”水平的菌群結(jié)構(gòu)）

5.? IBD相關(guān)微生物與代謝物的關(guān)聯(lián)機制

微生物與代謝物之間的正相關(guān)性反映了兩者之間的協(xié)同效應，為了確定這種關(guān)系，本研究對具有代表性的差異豐度菌種和代謝物進行關(guān)聯(lián)分析（線性模型），發(fā)現(xiàn)了15,679例FDR（q＜0.05）關(guān)聯(lián)，其中乳酸與Pediococcus acidilactici呈正相關(guān)（r= 0.23，Spearman）。經(jīng)過嚴格篩選，最終得到2279例關(guān)聯(lián)（圖6），其中包括122例標準和特征菌“種”的關(guān)聯(lián)（圖7.a），901個代謝物聚類簇，1878個豐度差異代謝物。然而，這些關(guān)聯(lián)僅有6%是具有統(tǒng)計學意義且在對照組（健康人群）中被證實的。ETA（廿碳三烯酸）和DPA（二十二碳五烯酸，與CD相關(guān)的代謝物）與對照組相關(guān)的菌種呈負相關(guān)（Eubacterium ventriosum），與IBD相關(guān)的菌種呈正相關(guān)（R. gnavus）（圖7.b.7.c）。CA（辛酸）對照組中高度關(guān)聯(lián)的厭氧菌（Alistipes shahii、Alistipes putredinis和Alistipes finegoldii）正相關(guān)，與R. gnavus顯著負相關(guān)（圖7.d）。

（圖6.）

（圖7. IBD相關(guān)微生物和代謝物的潛在關(guān)聯(lián)）

6.? IBD代謝相關(guān)微生物的功能

基于線性模型分析IBD微生物組的酶功能（EM）。與對照組相比，568種酶的豐度在UC或CD患者中差異顯著（FDR，q＜0.05）（圖8.），其中246種酶不受任何單一菌種支配。UC和CD患者均富集有鎂離子轉(zhuǎn)運ATP酶（EC 3.6.3.2）（圖9.a）和乙醇胺氨裂合酶（EC 4.3.1.7）（相對于對照組）（圖9.b），而乙醇胺氨裂合酶與甘油磷脂的合成有關(guān)，后者在UC和CD患者的代謝物中富集最多（圖3.a）。谷胱甘肽還原酶（EC 1.8.1.7）在IBD患者中也有較高豐度（圖9.c）；丙酮酸合成酶（EC 1.2.7.1）在對照組中富集，在CD患者中完全未檢測到（圖9.d）；維生素B12（如前咕啉，EC 1.3.1.76）在對照組含量較高（圖9.e）。四吡咯可能是維生素B12的衍生物和相關(guān)化合物，它在LC-MS代謝組分析中普遍存在，并且在IBD患者中富集（圖4.b）。

“代謝組-基因功能（酶）”關(guān)聯(lián)模型遵循“菌種-基因功能（酶）”關(guān)聯(lián)，多數(shù)代謝物僅與少數(shù)基因功能（酶）存在小部分（3%）關(guān)聯(lián)（反之亦然），而多數(shù)（95%）“代謝組-基因功能（酶）”關(guān)聯(lián)與IBD的發(fā)病機理有關(guān)。這些小部分“代謝組-基因功能（酶）”關(guān)聯(lián)中，鎂離子轉(zhuǎn)運ATP酶與羥基十四烷酸顯著負相關(guān)（r=-0.492，Spearman）（圖9.f），precorrin-2脫氫酶與正已酸正相關(guān)（r=0.507）（圖9.g）。

（圖8.）

（圖9. IBD代謝相關(guān)微生物的功能）

7.? Multi-omic特征區(qū)分群組中IBD子集

最后，本研究從代謝物、微生物菌“種”及兩者組合水平訓練“隨機森林”（RF）分類器，鑒定IBD病癥和IBD子集，受試者工作曲線（ROC）描繪RF分類器的假陽性率和準確率，混合矩陣評估PRISM隊列IBD子集RF分類器。結(jié)果顯示，所有RF分類器對IBD患者和健康人群的辨識效果良好，AUC值為0.86-0.92，交叉驗證結(jié)果（AUC：0.90-0.92）更優(yōu)于獨立驗證結(jié)果（AUC：0.86-0.89）（圖10.a）。PRISM隊列中，代謝物、微生物菌“種”及兩者組合水平預測UC、CD和健康人群的準確率為64-65%，該結(jié)果雖然不如案例/對照成功，但仍高于隨機預測（正確率：30%）（圖10.b），將PRISM訓練IBD子集RF分類器應用于荷蘭人群時（用于人類疾病驗證），輸入數(shù)據(jù)類型之間差異較大（圖10.b）。

（圖10.腸道微生物Multi-Omics analysis預測IBD病癥及子集）

下載英文文獻全文

===其他相關(guān)研究（代謝組學+宏基因組學）===

1. 嬰兒腸道微生物在發(fā)育和Ⅰ型糖尿病發(fā)展中的動態(tài)變化

Kostic A D, Gevers D, Siljander H, et al. The dynamics of the human infant gut microbiome in development and in progression toward typeⅠdiabetes [J]. Cell host & microbe, 2015, 17(2): 260-273.

2. 二甲雙胍改變了治療初期Ⅰ型糖尿病患者的腸道微生物，促進了該藥的療效

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3. 藥物治療對心血管疾病模型（apo-E?/?）小鼠腸道微生物和代謝物的影響

Ryan P M, London L E E, Bjorndahl T C, et al. Microbiome and metabolome modifying effects of several cardiovascular disease interventions in apo-E?/? mice [J]. Microbiome, 2017, 5(1): 30.

 

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